Генетичният материал на еукариотните организми има много сложна организация. ДНК молекулите, разположени в клетъчното ядро, са част от специално многокомпонентно вещество - хроматин.
Дефиниция на понятието
Хроматинът е материалът на клетъчното ядро, съдържащ наследствена информация, който представлява сложен функционален комплекс от ДНК със структурни протеини и други елементи, които осигуряват опаковането, съхранението и внедряването на кариотния геном. В опростена интерпретация това е веществото, от което са изградени хромозомите. Терминът идва от гръцкия "хром" - цвят, боя.
Концепцията е въведена от Флеминг през 1880 г., но все още има дебат за това какво е хроматин по отношение на биохимичния състав. Несигурността засяга малка част от компонентите, които не участват в структурирането на генетичните молекули (някои ензими и рибонуклеинови киселини).
При електронната фотография на интерфазното ядро хроматинът се визуализира като множество области от тъмна материя, които могат да бъдат малки и разпръснати или комбинирани в големи плътни клъстери.
Кондензацията на хроматин по време на клетъчното делене води до образуването на хромозоми, които се виждат дори в конвенционален светлинен микроскоп.
Структурни и функционални компоненти на хроматина
За да определят какво представлява хроматинът на биохимично ниво, учените извличат това вещество от клетките, прехвърлят го в разтвор и в тази форма изследват неговия компонентен състав и структура. Използвани са както химични, така и физични методи, включително технологии за електронна микроскопия. Оказа се, че химичният състав на хроматина е 40% представен от дълги ДНК молекули и почти 60% от различни протеини. Последните се делят на две групи: хистони и нехистони.
Хистоните са голямо семейство от основни ядрени протеини, които се свързват здраво с ДНК, образувайки структурния скелет на хроматина. Техният брой е приблизително равен на процента на генетичните молекули.
Останалата част (до 20%) от протеиновата фракция представлява ДНК-свързващи и пространствено модифициращи протеини, както и ензими, участващи в процесите на четене и копиране на генетична информация.
В допълнение към основните елементи, рибонуклеинови киселини (РНК), гликопротеини, въглехидрати и липиди се намират в малки количества в хроматина, но въпросът за тяхната връзка с ДНК опаковъчния комплекс все още е отворен.
Хистони и нуклеозоми
Молекулното тегло на хистоните варира от 11 до 21 kDa. Големият брой основни аминокиселинни остатъци лизин и аргинин придават на тези протеини положителен заряд, насърчавайки образуването на йонни връзки с противоположно заредените фосфатни групи на двойната спирала на ДНК.
Има 5 вида хистони: H2A, H2B, H3, H4 и H1. Първите четири типа участват в образуването на основната структурна единица на хроматина - нуклеозомата, която се състои от ядро (протеиново ядро) и ДНК, обвита около него.
Ядрото на нуклеозомата е представено от октамерен комплекс от осем хистонови молекули, който включва тетрамер H3-H4 и димер H2A-H2B. ДНК секция от около 146 нуклеотидни двойки се навива върху повърхността на протеиновата частица, образувайки 1,75 навивки и преминава в линкерна последователност (приблизително 60 bp), свързваща нуклеозомите една с друга. Молекулата Н1 се свързва с линкерната ДНК, предпазвайки я от действието на нуклеазите.
Хистоните могат да претърпят различни модификации, като ацетилиране, метилиране, фосфорилиране, ADP-рибозилиране и взаимодействие с убиквитин протеин. Тези процеси влияят върху пространствената конфигурация и плътността на опаковане на ДНК.
Нехистонови протеини
Има няколкостотин вида нехистонови протеини с различни свойства и функции. Тяхното молекулно тегло варира от 5 до 200 kDa. Специална група се състои от сайт-специфични протеини, всеки от които е комплементарен към специфичен регион на ДНК. Тази група включва 2 семейства:
- “цинкови пръсти” – разпознават фрагменти с дължина 5 нуклеотидни двойки;
- хомодимери – характеризиращи се със структура спирала-завой-спирала във фрагмента, свързан с ДНК.
Най-добре проучени са така наречените протеини с висока подвижност (HGM протеини), които са постоянно свързани с хроматина. Семейството получи това име поради високата скорост на движение на протеиновите молекули в гел за електрофореза. Тази група заема по-голямата част от нехистоновата фракция и включва четири основни типа HGM протеини: HGM-1, HGM-14, HGM-17 и HMO-2. Те изпълняват структурни и регулаторни функции.
Нехистоновите протеини също включват ензими, които осигуряват транскрипция (процес на синтез на информационна РНК), репликация (удвояване на ДНК) и възстановяване (елиминиране на увреждане в генетичната молекула).
Нива на уплътняване на ДНК
Особеността на структурата на хроматина е такава, че позволява нишки на ДНК с обща дължина над един метър да се поберат в ядро с диаметър около 10 микрона. Това е възможно благодарение на многоетапна система за опаковане на генетични молекули. Общата схема на уплътняване включва пет нива:
- нуклеозомна нишка с диаметър 10–11 nm;
- фибрил 25–30 nm;
- кръгови домейни (300 nm);
- 700 nm дебелина на влакното;
- хромозоми (1200 nm).
Тази форма на организация осигурява намаляване на дължината на оригиналната ДНК молекула с 10 хиляди пъти.
Нишка с диаметър 11 nm се образува от редица нуклеозоми, свързани с ДНК линкерни области. На електронна микроснимка такава структура прилича на мъниста, нанизани на въдица. Нуклеозомната нишка се сгъва в спирала като соленоид, образувайки фибрила с дебелина 30 nm. Хистон Н1 участва в образуването му.
Соленоидната фибрила се сгъва в бримки (иначе известни като домейни), които са закотвени към поддържащата вътрешноядрена матрица. Всеки домейн съдържа от 30 до 100 хиляди базови двойки. Това ниво на уплътняване е характерно за интерфазния хроматин.
Структура с дебелина 700 nm се образува чрез спирализиране на фибрила на домен и се нарича хроматид. От своя страна двете хроматиди образуват петото ниво на организация на ДНК - хромозома с диаметър 1400 nm, която става видима на етапа на митоза или мейоза.
По този начин хроматинът и хромозомата са форми на опаковане на генетичен материал, които зависят от жизнения цикъл на клетката.
Хромозоми
Хромозомата се състои от две идентични сестрински хроматиди, всяка от които е образувана от една свръхнавита ДНК молекула. Половинките са свързани чрез специално фибрилно тяло, наречено центромер. В същото време тази структура е стеснение, което разделя всеки хроматид на рамена.
За разлика от хроматина, който е структурен материал, хромозомата е дискретна функционална единица, характеризираща се не само със структура и състав, но и с уникален генетичен набор, както и с определена роля в осъществяването на механизмите на наследствеността и променливостта при клетъчно ниво.
Еухроматин и хетерохроматин
Хроматинът в ядрото съществува в две форми: по-малко спираловиден (еухроматин) и по-компактен (хетерохроматин). Първата форма съответства на транскрипционно активни региони на ДНК и следователно не е толкова тясно структурирана. Хетерохроматинът е разделен на факултативен (може да премине от активна форма в плътна неактивна, в зависимост от етапа на жизнения цикъл на клетката и необходимостта от внедряване на определени гени) и конститутивен (постоянно уплътнен). По време на митотично или мейотично делене целият хроматин е неактивен.
Конститутивният хетерохроматин се намира близо до центромерите и в крайните области на хромозомата. Резултатите от електронната микроскопия показват, че такъв хроматин запазва висока степен на кондензация не само на етапа на клетъчно делене, но и по време на интерфазата.
Биологична роля на хроматина
Основната функция на хроматина е да опакова плътно големи количества генетичен материал. Обаче простото поставяне на ДНК в ядрото не е достатъчно, за да функционира една клетка. Необходимо е тези молекули да „работят“ правилно, т.е. да могат да предават съдържащата се в тях информация чрез системата ДНК-РНК-протеин. Освен това клетката трябва да разпредели генетичен материал по време на деленето.
Структурата на хроматина напълно отговаря на тези задачи. Протеиновата част съдържа всички необходими ензими, а структурните характеристики им позволяват да взаимодействат с определени участъци от ДНК. Следователно втората важна функция на хроматина е да осигури всички процеси, свързани с изпълнението на ядрения геном.
Лекция No 2.13.9.11. „Етапи на формирането на клетъчната теория. Клетката като структурна единица на живите същества"
Етапи на развитие на клетъчната теория:
1) 1665 г. - Р. Хук дава името на клетката - „cellula“
2) 1839 - Шлейден и Шван предлагат нова клетка. теория
Клетка - структурна единица на растенията и животните
Процесът на образуване на клетки определя техния растеж и развитие
1858 – Вирхов е добавен към клетката. теория
"Всяка клетка от клетка"
3) модерна клетка. теория
Клетката е основната структурна и функционална единица на всички живи същества.
Клетките на един многоклетъчен организъм са сходни по структура, състав и важни прояви на жизнената активност
Размножаване – делене на оригиналната майчина клетка
Клетките на многоклетъчния организъм, според функциите си, образуват тъкани → органи → системи от органи → организъм
Общ план на структурата на еукариотната клетка.
Три основни компонента на клетката:
1)цитоплазмена мембрана (плазмалема)
Липиден двоен слой и един слой протеини се намират на повърхността на липидния слой или са потопени в него.
Функции:
Демаркация
транспорт
Защитен
Рецептор (сигнал)
2)цитоплазма:
а) хиалоплазма (колоидален разтвор на протеини, фосфолипиди и други вещества. Може да бъде гел или зол)
Функции на хиалоплазмата:
транспорт
Хомеостатичен
Метаболизъм
Създаване на оптимални условия за функциониране на органелите
б) Органели – постоянни компоненти на цитоплазмата, които имат специфичен структура и изпълнение деф. функции.
Класификация на органелите:
○ по локализация:
Ядрени (нуклеоли и хромозоми)
Цитоплазма (ER, рибозоми)
○ по структура:
Мембрана:
а) едномембранни (лизозоми, ER, апарат на Голджи, вакуоли, пероксизоми, сферозоми)
б) двойномембранни (пластиди, митохондрии)
Немембранни (рибозоми, микротубули, миофибрили, микрофиламенти)
○ по предназначение:
Общи (намира се във всички клетки)
Специални (намират се в определени клетки - пластиди, реснички, флагели)
○ по размер:
Вижда се под светлинен микроскоп (ER, апарат на Голджи)
Невидими под светлинен микроскоп (рибозоми)
Включвания- непостоянни компоненти на клетката, които имат специфичен структура и изпълнение деф. функции.
3)сърцевина
Единична мембрана.
EPS (Ендоплазмен ретикулум, ретикулум).
Система от взаимосвързани кухини и тубули, свързани с външната ядрена мембрана.
Груб (гранулиран).Има рибозоми→ синтез на протеини
Гладка (агранулирана).Синтез на мазнини и въглехидрати.
Функции:
1) разграничаване
2) транспорт
3) отстраняване на токсични вещества от клетката
4) синтез на стероиди
Апарат на Голджи (ламеларен комплекс).
Купчини от сплескани тубули и цистерни, наречени диктозоми.
Диктозома– купчина от 3-12 сплескани диска, наречени цистерни (до 20 dicto)
Функции:
1) концентрация, освобождаване и уплътняване на междуклетъчната секреция
2) натрупване на глико- и липопротеини
3) натрупване и отстраняване на вещества от клетката
4) образуване на браздата на разцепване по време на митоза
5) образуване на първични лизозоми
Лизсома.
Везикула, заобиколена от единична мембрана и съдържаща хидролитични ензими.
Функции:
1) смилане на абсорбирания материал
2) унищожаване на бактерии и вируси
3) автолиза (разрушаване на клетъчни части и мъртви органели)
4)отстраняване на цели клетки и междуклетъчно вещество
Пероксизом.
Везикули, заобиколени от единична мембрана, съдържаща пероксидаза.
Функции- окисляване на орг. вещества
Сферозома.
Овални органели, заобиколени от единична мембрана, съдържаща мазнини.
Функции– синтез и натрупване на липиди.
Вакуоли.
Кухини в цитоплазмата на клетките, ограничени от единична мембрана.
В растенията (клетъчен сок - разтваряне на органични и неорганични вещества) и единични клетки. животни (храносмилателна, контрактилна - осморегулация и екскреция)
Двойна мембрана.
Ядро.
1)мембрана (кариолема):
Две мембрани, пронизани с пори
Между мембраните има перенуклеарно пространство
Външната мембрана е свързана към ER
Функции - защитни и транспортни
2)ядрени пори
3)ядрен сок:
Според физическите състояние, близко до хиалоплазмата
Химически съдържа повече нуклеинови киселини
4)нуклеоли:
Немембранни компоненти на ядрото
Може да има един или повече
Образува се в специфични области на хромозомите (нуклеоларни организатори)
Функции:
синтез на рРНК
tRNA синтез
Образуване на рибозома
5)хроматин– ДНК вериги + протеин
6)хромозома– силно спирализиран хроматин, съдържа гени
7)вискозна кариоплазма
Ултраструктура на хромозомите.
Хромозома → 2 хроматиди (свързани в областта на центромера) → 2 хемихроматиди → хромонема → микрофибрили (30-45% ДНК + протеин)
Сателит- регион на хромозома, разделен от вторично стесняване.
Теломер– крайна област на хромозомата
Видове хромозоми в зависимост от позицията на центромера:
1) равно рамо (метоцентрично)
2) неравни рамене (субметацентрични)
3) пръчковидна (акроцентрична)
Каротип– набор от данни за броя, формата и размера на хромозомите.
идиограма– графично изграждане на кариотип
Свойства на хромозомите:
1)постоянство на броя
При един вид броят на хромозомите винаги е постоянен.
2)сдвояване– в соматичните клетки всяка хромозома има своя собствена двойка (хомоложни хромозоми)
3)индивидуалност– всяка хромозома има свои собствени характеристики (размер, форма...)
4)приемственост– всяка хромозома от хромозома
Функции на хромозомите:
1) съхранение на наследствена информация
2) предаване на наследствена информация
3) прилагане на наследствена информация
Митохондриите.
1) състои се от 2 мембрани:
Външен (гладък, отвътре има издатини - кристи)
Външен (груб)
2) Вътре пространството е запълнено с матрица, в която има:
Рибозоми
Протеини - ензими
Функции:
1) Синтез на АТФ
2) синтез на митохондриални протеини
3) синтез на нуклони. киселини
4) синтез на въглехидрати и липиди
5) образуване на митохондриални рибозоми
Пластиди.
1) органели с двойна мембрана
2) вътре в стромата, в ct. разположени тилакоиди → grana
3) в стромата:
Рибозоми
Въглехидрати
Според цвета се разделят на:
1) хлоропласти (зелен, хлорофил).
2) хромопласти:
Жълто (ксантофил)
Червено (ликопектин)
Портокал (каротин)
Оцветяване на плодове, листа и корени.
3) левкопласти (безцветни, не съдържат пигменти). Запас от протеини, мазнини и въглехидрати.
Немембранни.
Рибозома
1) се състои от rRNA, протеин и магнезий
2) две субединици: голяма и малка
функция - протеинов синтез
Химичен състав на хромозомите
Физикохимична организация на хромозомите на еукариотната клетка
Изследването на химическата организация на хромозомите на еукариотните клетки показа, че те се състоят главно от ДНК и протеини, които образуват нуклеопротеинов комплекс - хроматин,получи името си заради способността си да се оцветява с основни багрила.
Както е доказано от множество изследвания (виж § 3.2), ДНК е материален носител на свойствата на наследствеността и променливостта и съдържа биологична информация - програма за развитие на клетка или организъм, записана със специален код. Количеството ДНК в ядрата на клетките на даден организъм от даден вид е постоянно и пропорционално на тяхната плоидност. В диплоидните соматични клетки на тялото е два пъти повече, отколкото в гаметите. Увеличаването на броя на хромозомните комплекти в полипластичните клетки е придружено от пропорционално увеличаване на количеството ДНК в тях.
Протеините съставляват значителна част от веществото на хромозомите. Те представляват около 65% от масата на тези структури. Всички хромозомни протеини са разделени на две групи: хистони и нехистонови протеини.
Хистонипредставени от пет фракции: HI, H2A, H2B, NZ, H4. Като положително заредени основни протеини, те се свързват доста здраво с молекулите на ДНК, което предотвратява разчитането на биологичната информация, съдържаща се в нея. Това е тяхната регулаторна роля. В допълнение, тези протеини изпълняват структурна функция, осигурявайки пространствената организация на ДНК в хромозомите (вижте раздел 3.5.2.2).
Брой фракции нехистоновипротеини надхвърля 100. Сред тях са ензими за синтез и обработка на РНК, редупликация и възстановяване на ДНК. Киселинните протеини на хромозомите също изпълняват структурни и регулаторни роли. В допълнение към ДНК и протеини, хромозомите също съдържат РНК, липиди, полизахариди и метални йони.
Хромозомна РНКпредставени отчасти от продукти на транскрипция, които все още не са напуснали мястото на синтеза. Някои фракции имат регулаторна функция.
Регулаторната роля на хромозомните компоненти е да „забраняват“ или „разрешават“ копирането на информация от ДНК молекулата.
Масовото съотношение на ДНК: хистони: нехистонови протеини: РНК: липиди е 1:1:(0,2-0,5):(0,1-0,15):(0,01--0,03). Други компоненти се намират в малки количества.
Докато поддържа приемственост през редица клетъчни поколения, хроматинът променя своята организация в зависимост от периода и фазата на клетъчния цикъл. В интерфазата, под светлинен микроскоп, се открива под формата на бучки, разпръснати в нуклеоплазмата на ядрото. По време на прехода на клетката към митоза, особено в метафазата, хроматинът придобива вид на ясно видими индивидуални интензивно оцветени тела - хромозоми.
Интерфазните и метафазните форми на съществуване на хроматина се разглеждат като два полярни варианта на неговата структурна организация, свързани в митотичния цикъл чрез взаимни преходи. Тази оценка е подкрепена от данни от електронна микроскопия, че както интерфазните, така и метафазните форми се основават на една и съща елементарна нишковидна структура. В процеса на електронномикроскопски и физикохимични изследвания в състава на интерфазния хроматин и метафазните хромозоми са идентифицирани нишки (фибрили) с диаметър 3,0-5,0, 10, 20-30 nm. Полезно е да запомните, че диаметърът на двойната спирала на ДНК е приблизително 2 nm, диаметърът на нишковидната структура на интерфазния хроматин е 100-200 nm, а диаметърът на една от сестринските хроматиди на метафазната хромозома е 500 -600 nm.
Най-разпространената гледна точка е, че хроматинът (хромозомата) е спирална нишка. В този случай се разграничават няколко нива на спирализация (компактизация) на хроматина (Таблица 3.2).
Таблица 3.2. Последователни нива на уплътняване на хроматина
ориз. 3.46. Нуклеозомна организация на хроматина.
А -декондензирана форма на хроматин;
Б -електронна микроснимка на еукариотен хроматин:
А -ДНК молекулата е навита върху протеинови ядра;
Б -хроматинът е представен от нуклеозоми, свързани с линкерна ДНК
Нуклеозомна нишка.Това ниво на организация на хроматина се осигурява от четири вида нуклеозомни хистони: H2A, H2B, H3, H4. Те образуват протеинови тела с форма на шайба - кора,състоящ се от осем молекули (по две молекули от всеки тип хистон) (фиг. 3.46).
Молекулата на ДНК е завършена с протеинови ядра, спирално навити върху тях. В този случай ДНК секция, състояща се от 146 нуклеотидни двойки (bp), е в контакт с всяко ядро. Наричат се области на ДНК, свободни от контакт с протеинови тела свързващи веществаили линкер.Те включват от 15 до 100 bp. (60 bp средно) в зависимост от типа клетка.
Сегмент от ДНК молекула с дължина около 200 bp. заедно с протеиновото ядро, което изгражда нуклеозома.Благодарение на тази организация структурата на хроматина се основава на нишка, която е верига от повтарящи се единици - нуклеозоми (фиг. 3.46, б). В това отношение човешкият геном, състоящ се от 3 × 10 9 bp, е представен от двойна спирала на ДНК, опакована в 1,5 × 10 7 нуклеозоми.
По продължение на нуклеозомната нишка, която прилича на верига от мъниста, има участъци от ДНК, свободни от протеинови тела. Тези региони, разположени на интервали от няколко хиляди базови двойки, играят важна роля в последващото опаковане на хроматина, тъй като съдържат нуклеотидни последователности, специфично разпознати от различни нехистонови протеини.
В резултат на нуклеозомната организация на хроматина, двойна спирала на ДНК с диаметър 2 nm придобива диаметър 10-11 nm.
Хроматинови фибрили.По-нататъшното уплътняване на нуклеозомната нишка се осигурява от буталото HI, което, свързвайки се с линкерната ДНК и две съседни протеинови тела, ги приближава един до друг. Резултатът е по-компактна структура, вероятно изградена като соленоид. Този хроматинов фибрил, наричан още елементарен,има диаметър 20-30 nm (фиг. 3.47).
Интерфазна хромонема.Следващото ниво на структурна организация на генетичния материал се дължи на сгъването на хроматиновите фибрили в бримки. В тяхното образуване очевидно участват нехистонови протеини, които са способни да разпознават специфични нуклеотидни последователности на екстрануклеозомна ДНК, отдалечени една от друга на разстояние от няколко хиляди нуклеотидни двойки. Тези протеини обединяват тези области, за да образуват бримки от фрагменти от хроматиновите фибрили, разположени между тях (фиг. 3.48). ДНК секцията, съответстваща на една бримка, съдържа от 20 000 до 80 000 bp. Може би всяка бримка е функционална единица на генома. В резултат на това опаковане хроматинова фибрила с диаметър 20-30 nm се трансформира в структура с диаметър 100-200 nm, т.нар. интерфазна хромонема.
Отделни участъци от интерфазната хромонема претърпяват допълнително уплътняване, образувайки се структурни блокове,обединяване на съседни контури със същата организация (фиг. 3.49). Те се откриват в интерфазното ядро под формата на хроматинови бучки. Може би съществуването на такива структурни блокове определя модела на неравномерно разпределение на някои багрила в метафазните хромозоми, който се използва в цитогенетичните изследвания (виж раздели 3.5.2.3 и 6.4.3.6).
Нееднаквата степен на уплътняване на различните участъци от интерфазните хромозоми е от голямо функционално значение. В зависимост от състоянието на хроматина те се разграничават еухроматиченобласти на хромозоми, които се характеризират с по-ниска плътност на опаковане в неделящи се клетки и потенциално се транскрибират, и хетерохроматиченобласти, характеризиращи се с компактна организация и генетична инерция. В техните граници не се извършва транскрипция на биологична информация.
Има конститутивен (структурен) и факултативен хетерохроматин.
Конститутивнахетерохроматинът се съдържа в перицентромерните и теломерните области на всички хромозоми, както и в някои вътрешни фрагменти на отделни хромозоми (фиг. 3.50). Образува се само от нетранскрибирана ДНК. Вероятно неговата роля е да поддържа общата структура на ядрото, да прикрепя хроматина към ядрената обвивка, да разпознава взаимно хомоложни хромозоми в мейозата, да отделя съседни структурни гени и да участва в процесите на регулиране на тяхната активност.
ориз. 3.49. Структурни блокове в организацията на хроматина.
А -бримкова хроматинова структура;
Б -по-нататъшна кондензация на хроматиновите бримки;
В -комбиниране на бримки с подобна структура в блокове за формиране на крайната форма на интерфазната хромозома
ориз. 3.50. Конститутивен хетерохроматин в човешки метафазни хромозоми
Пример по желаниехетерохроматинът служи като тяло на половия хроматин, обикновено образуван в клетките на организми от хомогаметичен пол (при хората женският пол е хомогаметичен) от една от двете X хромозоми. Гените на тази хромозома не се транскрибират. Образуването на факултативен хетерохроматин, дължащ се на генетичния материал на други хромозоми, придружава процеса на клетъчна диференциация и служи като механизъм за изключване от активни функционални групи на гени, чиято транскрипция не се изисква в клетки с дадена специализация. В тази връзка хроматиновият модел на клетъчните ядра от различни тъкани и органи върху хистологичните препарати варира. Пример за това е хетерохроматизацията на хроматина в ядрата на зрелите еритроцити на птици.
Изброените нива на структурна организация на хроматина се намират в неделяща се клетка, когато хромозомите все още не са достатъчно уплътнени, за да бъдат видими в светлинен микроскоп като отделни структури. Само някои от техните области с по-висока плътност на опаковане се откриват в ядрата под формата на хроматинови бучки (фиг. 3.51).
ориз. 3.51. Хетерохроматин в интерфазното ядро
Компактните области на хетерохроматина са групирани близо до ядрото и ядрената мембрана
Метафазна хромозома.Влизането на клетка от интерфаза в митоза е придружено от суперуплътняване на хроматина. Индивидуалните хромозоми стават ясно видими. Този процес започва в профаза, достигайки максималната си експресия в метафазата на митозата и анафазата (виж раздел 2.4.2). В телофазата на митозата настъпва декомпактизация на хромозомното вещество, което придобива структурата на интерфазен хроматин. Описаното митотично суперкомпактиране улеснява разпределението на хромозомите към полюсите на митотичното вретено в анафазата на митозата. Степента на уплътняване на хроматина в различни периоди от митотичния цикъл на клетката може да се оцени от данните, дадени в табл. 3.2.
Хроматинът, основният компонент на клетъчното ядро, се получава доста лесно от изолирани интерфазни ядра и от изолирани митотични хромозоми. За да направят това, те използват способността му да преминава в разтворено състояние по време на екстракция с водни разтвори с ниска йонна сила или просто дейонизирана вода. В този случай участъци от хроматин набъбват и се превръщат в гел. За да се превърнат такива лекарства в истински разтвори, са необходими силни механични въздействия: разклащане, разбъркване, допълнителна хомогенизация. Това, разбира се, води до частично разрушаване на оригиналната структура на хроматина, раздробяването му на малки фрагменти, но практически не променя химичния му състав.
Хроматиновите фракции, получени от различни обекти, имат доста еднакъв набор от компоненти. Установено е, че общият химичен състав на хроматина от интерфазните ядра и митотичните хромозоми се различава малко един от друг. Основните компоненти на хроматина са ДНК и протеини, по-голямата част от които са хистони и нехистонови протеини (вижте таблица 3).
Таблица 3.Химичен състав на хроматина. Съдържанието на протеин и РНК е дадено спрямо ДНК
Средно около 40% от хроматина е ДНК и около 60% са протеини, включително специфични ядрени протеини - хистони, съставляват от 40 до 80% от всички протеини, които изграждат изолирания хроматин. Освен това хроматиновата фракция включва мембранни компоненти, РНК, въглехидрати, липиди и гликопротеини. Въпросът доколко тези второстепенни компоненти са включени в структурата на хроматина все още не е разрешен. Така, например, РНК може да бъде транскрибирана РНК, която все още не е загубила връзката си с ДНК шаблона. Други второстепенни компоненти могат да представляват вещества от коутаени фрагменти от ядрената мембрана.
Структурно, хроматинът е нишковиден комплекс от дезоксирибонуклеопротеинови (DNP) молекули, които се състоят от ДНК, свързана с хистони (виж Фиг. 57). Следователно друго име за хроматин се е вкоренило - нуклеохистон. Благодарение на асоциирането на хистоните с ДНК се образуват много лабилни, вариабилни комплекси нуклеинова киселина-хистон, където съотношението ДНК:хистон е приблизително едно, т.е. те присъстват в равни тегловни количества. Тези нишковидни DNP фибрили са елементарни хромозомни или хроматинови нишки, чиято дебелина, в зависимост от степента на пакетиране на ДНК, може да варира от 10 до 30 nm. Тези DNP фибрили могат от своя страна да бъдат допълнително уплътнени, за да образуват по-високи нива на DNP структуриране, до митотичната хромозома. Ролята на някои нехистонови протеини е именно в образуването на високи нива на уплътняване на хроматина.
ДНК хроматин
В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула, подобна на чистата изолирана ДНК във водни разтвори. Това се доказва от много експериментални данни. По този начин, когато разтворите на хроматин се нагряват, се наблюдава повишаване на оптичната плътност на разтвора, така нареченият хиперхромен ефект, свързан с разкъсването на междунуклеотидните водородни връзки между ДНК веригите, подобно на това, което се случва, когато чистата ДНК се нагрява (стопи) .
Въпросът за размера и дължината на ДНК молекулите в хроматина е важен за разбирането на структурата на хромозомата като цяло. Използвайки стандартни методи за изолиране на ДНК, хроматинът има молекулно тегло 7-9 x 10 6, което е значително по-малко от молекулното тегло на ДНК от Escherichia coli (2,8 x 10 9). Такова относително ниско молекулно тегло на ДНК от хроматинови препарати може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на процеса на изолиране на хроматин. Ако ДНК се изолира при условия, които изключват разклащане, хомогенизиране и други влияния, е възможно да се получат много дълги ДНК молекули от клетките. Дължината на ДНК молекулите от ядрата и хромозомите на еукариотните клетки може да бъде изследвана с помощта на метода на светлинно-оптична авторадиография, точно както беше изследвано върху прокариотни клетки.
Установено е, че в рамките на хромозомите дължината на отделните линейни (за разлика от прокариотните хромозоми) ДНК молекули може да достигне стотици микрометри и дори няколко сантиметра. По този начин, ДНК молекули с размери от 0,5 mm до 2 cm са получени от различни обекти. Тези резултати показват, че има тясно съответствие между изчислената дължина на ДНК на хромозома и авторадиографското наблюдение.
След лек лизис на еукариотни клетки, молекулните тегла на ДНК могат да бъдат директно определени чрез физикохимични методи. Доказано е, че максималното молекулно тегло на ДНК молекула на Drosophila е 41 x 10 9, което съответства на дължина от около 2 cm. При някои дрожди има ДНК молекула на хромозома с молекулно тегло 1 x 10 8. -10 9, което е с размери около 0,5 mm.
Такава дълга ДНК е една единствена молекула, а не няколко по-къси, зашити заедно в един файл с помощта на протеинови връзки, както смятат някои изследователи. До този извод се стигна, след като се оказа, че дължината на ДНК молекулите не се променя след третиране на лекарства с протеолитични ензими.
Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид на вид, въпреки че при микроорганизмите количеството ДНК на клетка е значително по-ниско, отколкото при безгръбначните, висшите растения и животните. Така една мишка има почти 600 пъти повече ДНК на ядро от Е. coli. Когато се сравнява количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се установи някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Такива различни организми като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглен и бик (6,4 и 7 pg) имат приблизително еднакво количество ДНК.
Има значителни колебания в количеството на ДНК в големи таксономични групи. Сред висшите растения количеството на ДНК в различните видове може да се различава стотици пъти, точно както сред рибите количеството на ДНК в земноводните се различава десетки пъти.
Някои земноводни имат 10-30 пъти повече ДНК в ядрата си, отколкото в човешките ядра, въпреки че генетичната конституция на хората е несравнимо по-сложна от тази на жабите. Следователно може да се предположи, че „излишното“ количество ДНК в по-ниско организираните организми или не е свързано с изпълнението на генетична роля, или броят на гените се повтаря един или друг брой пъти.
Таблица 4. Съдържание на ДНК в клетките на някои обекти (pg, 10 -12 g)
Оказа се, че е възможно да се решат тези проблеми чрез изучаване на кинетиката на реакцията на ренатурация или ДНК хибридизация. Ако фрагментираните ДНК молекули в разтвори се подложат на термична денатурация и след това се инкубират при температура, малко по-ниска от тази, при която се извършва денатурацията, тогава първоначалната двойноверижна структура на ДНК фрагментите се възстановява поради повторното обединяване на комплементарни вериги - ренатурация. За ДНК вируси и прокариотни клетки беше показано, че скоростта на такава ренатурация директно зависи от размера на генома; колкото по-голям е геномът, толкова по-голямо е количеството ДНК на частица или клетка, толкова повече време е необходимо за случайния подход на комплементарни вериги и специфичното повторно свързване на по-голям брой ДНК фрагменти, различни по нуклеотидна последователност (фиг. 53). Характерът на кривата на реасоцииране на ДНК на прокариотните клетки показва липсата на повтарящи се базови последователности в прокариотния геном; всички участъци от тяхната ДНК носят уникални последователности, чийто брой и разнообразие отразяват степента на сложност на генетичния състав на обектите и, следователно, тяхната обща биологична организация.
Напълно различна картина на реасоциацията на ДНК се наблюдава при еукариотните организми. Оказа се, че тяхната ДНК съдържа фракции, които се ренатурират с много по-висока скорост, отколкото би се очаквало въз основа на размера на техния геном, както и фракция от ДНК, която се ренатурира бавно, като уникалните ДНК последователности на прокариотите. Еукариотите обаче изискват значително повече време, за да ренатурират тази фракция, което е свързано с общия голям размер на техния геном и големия брой различни уникални гени.
В тази част от еукариотната ДНК, която се характеризира с висока степен на ренатурация, се разграничават две подфракции: 1) фракция с много или често повтарящи се последователности, където подобни ДНК участъци могат да се повторят 10 6 пъти; 2) фракция от умерено повтарящи се последователности, които се срещат 10 2 -10 3 пъти в генома. Така при една мишка ДНК фракцията с често повтарящи се последователности включва 10% от общото количество ДНК на геном и 15% се отчитат от фракцията с умерено повтарящи се последователности. Останалите 75% от цялата миша ДНК е представена от уникални региони, съответстващи на голям брой различни неповтарящи се гени.
Фракции с много повтарящи се последователности могат да имат различна плаваща плътност от по-голямата част от ДНК и следователно могат да бъдат изолирани в чиста форма като така наречените фракции сателитна ДНК. При мишката тази фракция е с плътност 1,691 g/ml, а основната част от ДНК е 1,700 g/ml. Тези разлики в плътността се определят от разликите в нуклеотидния състав. Например, в една мишка има 35% G и C двойки в тази фракция и 42% в основния пик на ДНК.
Както се оказа, сателитната ДНК или фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности не участва в синтеза на основните видове РНК в клетката и не е свързана с процеса на синтез на протеини. Това заключение е направено въз основа на факта, че нито един от видовете клетъчна РНК (tRNA, mRNA, rRNA) не хибридизира със сателитна ДНК. Следователно, тези ДНК не съдържат последователности, отговорни за синтеза на клетъчна РНК, т.е. сателитните ДНК не са матрици за синтеза на РНК и не участват в транскрипцията.
Има хипотеза, че много повтарящи се последователности, които не са пряко включени в протеиновия синтез, могат да носят информация, която играе важна структурна роля в поддържането и функционирането на хромозомите. Те могат да включват множество участъци от ДНК, свързани с основните протеини на интерфазното ядро (виж по-долу), места в началото на репликация или транскрипция, както и участъци от ДНК, които регулират тези процеси.
Използване на метода на хибридизация на нуклеинови киселини директно върху хромозоми ( in situ) е изследвана локализацията на тази фракция. За да се направи това, РНК, белязана с 3Н-уридин, се синтезира върху изолирана сателитна ДНК с помощта на бактериални ензими. След това цитологичният препарат с хромозоми се подлага на обработка, която предизвиква денатурация на ДНК (повишена температура, алкална среда и др.). След това върху препарата се поставя 3H-маркирана РНК и се постига хибридизация между ДНК и РНК. Авторадиографията показва, че по-голямата част от етикета е локализирана в зоната на първичните стеснения на хромозомите, в зоната на техните центромерни области. Белегът се открива и в други области на хромозомите, но много слабо (фиг. 54).
През последните 10 години бяха направени големи крачки в обучението центромерна ДНК, особено в клетките на дрождите. Така и направете S. cerevisiaeЦентромерната ДНК се състои от повтарящи се области от 110 bp. Състои се от две запазени области (I и III) и централен елемент (II), обогатен с AT базови двойки. Хромозомите на Drosophila имат подобна центромерна ДНК структура. Човешка центромерна ДНК (алфоидна сателитна ДНК) се състои от тандем от 170 bp мономери, организирани в групи от димери или пентамери, които на свой ред образуват големи последователности от 1-6 x 103 bp. Тази най-голяма единица се повтаря 100-1000 пъти. Специални центромерни протеини са в комплекс с тази специфична центромерна ДНК и участват в образуването кинетохор, структура, която осигурява връзката на хромозомите с вретеновидни микротубули и при движението на хромозомите в анафаза (виж по-долу).
ДНК със силно повтарящи се последователности също е открита в теломерни областихромозоми на много еукариотни организми (от дрожди до хора). Тук най-често се срещат повторения, които включват 3-4 гуанинови нуклеотида. При хората теломерите съдържат 500-3000 TTAGGG повторения. Тези участъци от ДНК изпълняват специална роля - да ограничат краищата на хромозомата и да предотвратят нейното скъсяване по време на процеса на повторна репликация.
Наскоро беше установено, че силно повтарящи се ДНК последователности на интерфазни хромозоми се свързват специфично с ламинови протеини, лежащи в основата на ядрената обвивка и участват в закрепването на разширени декондензирани интерфазни хромозоми, като по този начин определят реда в локализацията на хромозомите в обема на интерфазното ядро.
Предполага се, че сателитната ДНК може да участва в разпознаването на хомоложните области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения регионите с често повтарящи се последователности играят ролята на разделители (спейсъри) между различни функционални единици на хромозомна ДНК, например между репликони (виж по-долу).
Както се оказа, частта от умерено повтарящи се (от 10 2 до 10 5 пъти) последователности принадлежи към разнообразен клас от ДНК региони, които играят важна роля в процесите на създаване на апарата за синтез на протеини. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, които могат да се повторят 100 до 1000 пъти в различни видове. Тази фракция включва многократно повтарящи се региони за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също могат да се повтарят много пъти, представени от много копия. Това са гените за хроматиновите протеини - хистоните, повтарящи се до 400 пъти.
В допълнение, тази фракция включва ДНК участъци с различни последователности (100-400 нуклеотидни двойки всяка), също многократно повтарящи се, но разпръснати из целия геном. Тяхната роля все още не е напълно ясна. Предполага се, че такива ДНК участъци могат да представляват акцепторни или регулаторни области на различни гени.
И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав, съдържаща няколко класа нуклеотидни последователности: често повтарящи се последователности (> 10 6 пъти), включени в сателитната ДНК фракция и нетранскрибирани; фракция от умерено повтарящи се последователности (10 2 -10 5), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном; част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.
Въз основа на тези идеи разликите в количеството ДНК, които се наблюдават в различните организми, стават ясни: те могат да бъдат свързани с неравномерно съотношение на определени класове ДНК в генома на организмите. Така например в амфибия Амфиума(който има 20 пъти повече ДНК от човека) повтарящите се последователности съставляват до 80% от общата ДНК, в лука - до 70, в сьомгата - до 60% и т.н. Истинското богатство на генетична информация трябва да бъде отразено от частта от уникални последователности. Не трябва да забравяме, че в естествена, нефрагментирана ДНК молекула на хромозомата, всички региони, които включват уникални, умерено и често повтарящи се последователности, са свързани в една гигантска ковалентна ДНК верига.
ДНК молекулите са хетерогенни не само в области на различни нуклеотидни последователности, но също така се различават по своята синтетична активност.
Репликация на еукариотна ДНК
Бактериалната хромозома се репликира като една структурна единица, имаща една начална точка на репликация и една крайна точка. Така бактериалната кръгова ДНК е една репликон. От началната точка репликацията протича в две противоположни посоки, така че докато се синтезира ДНК, се образува така нареченото репликационно око, ограничено от двете страни с репликационни вилици, което се вижда ясно по време на електронно микроскопско изследване на вирусни и бактериални репликиращи се хромозоми .
В еукариотните клетки организацията на репликация е от различно естество - полирепликон Както вече беше споменато, с импулсното включване на 3 HT се появява множествен етикет в почти всички митотични хромозоми. Това означава, че едновременно има много места за репликация и много автономни източници на репликация в интерфазната хромозома. Това явление е изследвано по-подробно с помощта на авторадиография на белязани молекули, изолирани от ДНК (фиг. 55). Ако клетките са маркирани с 3 HT, тогава в светлинен микроскоп върху автографите на изолирана ДНК могат да се видят области с намалено сребро. под формата на пунктирани линии. Това са малки участъци от ДНК, които са успели да се репликират, а между тях има участъци от нерепликирана ДНК, която не е напуснала авторадиограф и следователно остава невидима. С увеличаването на времето за контакт на 3 NT с клетката размерът на тези сегменти се увеличава и разстоянието между тях намалява. От тези експерименти скоростта на репликация на ДНК в еукариотните организми може да бъде точно изчислена. Скоростта на движение на вилицата за репликация се оказа 1-3 kb. на минута при бозайници, около 1 kb. на минута в някои растения, което е много по-ниско от скоростта на репликация на ДНК в бактерии (50 kb на минута). В същите експерименти беше пряко доказана полирепликонната структура на ДНК на еукариотните хромозоми: по дължината на хромозомната ДНК, по протежение на нея, има много независими места за репликация - репликони. Според разстоянието между средните точки на съседни маркиращи репликони, т.е. Въз основа на разстоянието между две съседни начални точки на репликация може да се определи размерът на отделните репликони. Средно размерът на репликона на висшите животни е около 30 µm или 100 kb. Следователно трябва да има 20 000-30 000 репликони в хаплоидния набор от бозайници. При нисшите еукариоти репликоните са по-малки, около 40 kb. Така при Drosophila има 3500 репликона на геном, а при дрождите – 400. Както беше споменато, синтезът на ДНК в репликона протича в две противоположни посоки. Това може лесно да се докаже чрез авторадиография: ако клетките, след импулсно маркиране, се оставят да продължат да синтезират ДНК за известно време в среда без 3 HT, тогава включването му в ДНК ще намалее, ще настъпи разреждане на етикета и на на авторадиографа ще бъде възможно да се види симетричен модел от двете страни на репликирания регион, намалявайки броя на зърната редуцирано сребро.
Репликиращите се краища или разклонения в репликон спират да се движат, когато срещнат разклоненията на съседни репликони (в крайна точка, обща за съседните репликони). В този момент репликираните участъци от съседни репликони се комбинират в единични ковалентни вериги от две новосинтезирани ДНК молекули. Функционалното разделяне на хромозомната ДНК на репликони съвпада със структурното разделяне на ДНК на домени или бримки, чиито основи, както вече беше споменато, се държат заедно чрез протеинови връзки.
По този начин целият ДНК синтез на една хромозома се осъществява чрез независим синтез на много отделни репликони, последван от свързване на краищата на съседни ДНК сегменти. Биологичният смисъл на това свойство става ясен при сравняване на синтеза на ДНК при бактерии и еукариоти. Така се синтезира бактериална монорепликонна хромозома с дължина 1600 микрона със скорост около половин час. Ако една сантиметър дълга ДНК молекула на хромозома на бозайник също се репликира като структура на монорепликон, това ще отнеме около седмица (6 дни). Но ако такава хромозома съдържа няколкостотин репликони, тогава пълната й репликация ще отнеме само около час. Всъщност времето за репликация на ДНК при бозайниците е 6-8 часа. Това се дължи на факта, че не всички репликони на отделна хромозома са включени по едно и също време.
В някои случаи се наблюдава едновременно включване на всички репликони или появата на допълнителни източници на репликация, което прави възможно завършването на синтеза на всички хромозоми за минимално кратко време. Това явление възниква в началото на ембриогенезата на някои животни. Известно е, че при смачкване на яйцата на ноктести жаби Ксенопус laevisСинтезът на ДНК отнема само 20 минути, докато в културата на соматични клетки този процес продължава около един ден. Подобна картина се наблюдава при Drosophila: в ранните ембрионални стадии целият синтез на ДНК в ядрото отнема 3,5 минути, а в клетките на тъканната култура - 600 минути. В същото време размерът на репликоните в клетките на културата се оказа почти 5 пъти по-голям, отколкото в ембрионите.
Синтезът на ДНК протича неравномерно по дължината на отделната хромозома. Установено е, че в отделна хромозома активните репликони се събират в групи, репликативни единици, които включват 20-80 източника на репликация. Това следва от анализа на ДНК автографи, където се наблюдава точно такова блокиране на репликиращи се сегменти. Друга основа за идеята за съществуването на блокове или клъстери от репликони или репликационни единици са експерименти с включването на тимидинов аналог, 5'-бромодеоксиуридин (BrdU), в ДНК. Включването на BrdU в интерфазния хроматин води до факта, че по време на митоза областите с BrdU се кондензират в по-малка степен (недостатъчна кондензация) от тези области, където е включен тимидин. Следователно тези области на митотичните хромозоми, в които е включен BrdU, ще бъдат слабо оцветени по време на диференциалното оцветяване. Това прави възможно определянето на последователността на включване на BrdU с помощта на синхронизирани клетъчни култури, т.е. последователност на синтеза на ДНК по дължината на една хромозома. Оказа се, че включването на прекурсора в големи участъци от хромозомата се случва. Включването на различни секции става строго последователно през S-периода. Всяка хромозома се характеризира с висока стабилност на реда на репликация по дължината си и има свой собствен специфичен модел на репликация.
Клъстери от репликони, комбинирани в репликационни единици, са свързани с протеини на ядрената матрица (виж по-долу), които заедно с репликационните ензими образуват т.нар. клъстерозомите са зони в интерфазното ядро, в които се осъществява синтеза на ДНК.
Редът, в който се активират репликационните единици, вероятно може да се определи от структурата на хроматина в тези региони. Например, зоните на конститутивния хетерохроматин (близо до центромера) обикновено се репликират в края на S-периода, също така, в края на S-периода, част от факултативния хетерохроматин се удвоява (например, X хромозомата на женската); бозайници). Последователността на репликация на хромозомни участъци корелира особено ясно във времето с модела на диференциално оцветяване на хромозомите: R-сегментите принадлежат към ранно репликиращи се сегменти, G-сегментите съответстват на хромозомни участъци с късна репликация. С-сегментите (центромерите) са местата на последната репликация.
Тъй като в различните хромозоми размерът и броят на различните групи от различно оцветени сегменти са различни, това създава картина на асинхронното начало и край на репликацията на различните хромозоми като цяло. Във всеки случай последователността на началото и края на репликацията на отделните хромозоми в набора не е случайна. Съществува строга последователност на възпроизвеждане на хромозоми по отношение на другите хромозоми в набора.
Продължителността на процеса на репликация на отделните хромозоми не зависи пряко от техния размер. Така големите човешки хромозоми от група А (1-3) са белязани през целия S-период, както и по-късите хромозоми от група В (4-5).
По този начин синтезът на ДНК в еукариотния геном започва почти едновременно на всички хромозоми на ядрото в началото на S-периода. Но в същото време последователното и асинхронно включване на различни репликони се случва както в различни части на хромозомите, така и в различни хромозоми. Последователността на репликация на определен регион на генома е строго определена генетично. Това последно твърдение се доказва не само от модела на включване на етикета в различни сегменти на S-периода, но и от факта, че има строга последователност на поява на пикове в чувствителността на определени гени към мутагени по време на S - период.
Хроматин наречена сложна смес от вещества, от които са изградени еукариотните хромозоми. Основните компоненти на хроматина са ДНК, хистони и нехистонови протеини, които образуват силно подредени структури в пространството. Съотношението на ДНК и протеин в хроматина е ~ 1: 1, а по-голямата част от хроматиновия протеин е представен от хистони. Хистоните образуват семейство от силно запазени основни протеини, които са разделени на пет широки класа, наречени H1, H2A, H2B, H3 и H4. Размерът на хистоновите полипептидни вериги е в рамките на ~ 220 (H1) и 102 (H4)аминокиселинни остатъци. Хистон H1 е силно обогатен на остатъци Lysхистоните H2A и H2B се характеризират с умерено съдържание на Lys, полипептидните вериги на хистоните H3 и H4 са богати Арг. Във всеки клас хистони (с изключение на H4), няколко подтипа на тези протеини се разграничават въз основа на аминокиселинни последователности. Тази множественост е особено характерна за H1 хистоните на бозайниците. В този случай има седем подтипа, наречени H1.1–H1.5, H1 o и H1t.
ориз. I.2. Схематично представяне на нивото на бримковия домейн на уплътняване на хроматина
А– фиксиране на хромомерната бримка върху ядрената матрица с помощта на MAR/SAR последователности и протеини; b– „розетки“, образувани от бримка на хромометър; V– кондензация на розетни бримки с участието на нуклеозоми и нуклеомери
Важен резултат от взаимодействието на ДНК с протеините в хроматина е нейното уплътняване. Общата дължина на ДНК, съдържаща се в ядрото на човешките клетки, достига 1 m, докато средният диаметър на ядрото е 10 µm. Дължината на една ДНК молекула, съдържаща се в една човешка хромозома, е средно ~4 cm, а дължината на една метафазна хромозома е ~4 µm. Следователно, ДНК на човешките метафазни хромозоми е уплътнена по дължина най-малко 10 4 пъти. Степента на уплътняване на ДНК в интерфазните ядра е много по-ниска и неравномерна в отделните генетични локуси. От функционална гледна точка има еухроматин И хетерохроматин . Еухроматинът се характеризира с по-малко уплътняване на ДНК в сравнение с хетерохроматина и активно експресираните гени са локализирани главно в него. В момента има широко разпространено убеждение, че хетерохроматинът е генетично инертен. Тъй като истинските му функции не могат да се считат за установени днес, тази гледна точка може да се промени с натрупването на знания за хетерохроматина. В него вече се намират активно експресирани гени.
Хетерохроматизацията на определени хромозомни области често е придружена от потискане на транскрипцията на присъстващите в тях гени. Разширени участъци от хромозоми и дори цели хромозоми могат да бъдат включени в процеса на хетерохроматизация. Съответно, смята се, че регулирането на транскрипцията на еукариотния ген се извършва главно на две нива. В първия от тях уплътняването или декомпактизирането на ДНК в хроматина може да доведе до дългосрочно инактивиране или активиране на разширени участъци от хромозоми или дори цели хромозоми по време на онтогенезата на организма. По-фино регулиране на транскрипцията на активирани хромозомни региони се постига на второ ниво с участието на нехистонови протеини, включително множество транскрипционни фактори.
Структурна организация на хроматина и хромозомите в еукариотите.Въпросът за структурната организация на хроматина в интерфазните ядра в момента далеч не е разрешен. Това се дължи преди всичко на сложността и динамичността на нейната структура, която лесно се променя дори при незначителни външни влияния. Повечето от знанията за структурата на хроматина са получени in vitro върху препарати от фрагментиран хроматин, чиято структура се различава значително от тази в естествените ядра. В съответствие с общата гледна точка има три нива на структурна организация на хроматина в еукариотите: 1 ) нуклеозомна фибрила ; 2) соленоид , илинуклеомер ; 3) контурна домейн структура , включителнохромомери .
Нуклеозомни фибрили. При определени условия (при ниска йонна сила и в присъствието на двувалентни метални йони) е възможно да се наблюдават правилни структури в изолиран хроматин под формата на разширени фибрили с диаметър 10 nm, състоящи се от нуклеозоми. Тези фибриларни структури, в които нуклеозомите са подредени като мъниста на връв, се считат за най-ниското ниво на пакетиране на еукариотна ДНК в хроматина. Нуклеозомите, които изграждат фибрилите, са разположени повече или по-малко равномерно по дължината на ДНК молекулата на разстояние 10–20 nm една от друга. Нуклеозомите съдържат четири двойки хистонови молекули: H2a, H2b, H3 и H4, както и една хистонова молекула H1. Данните за структурата на нуклеозомите се получават главно с помощта на три метода: рентгенов дифракционен анализ с ниска и висока разделителна способност на нуклеозомни кристали, междумолекулни кръстосани връзки протеин-ДНК и разцепване на ДНК в нуклеозомите с помощта на нуклеази или хидроксилни радикали. Въз основа на тези данни А. Клуг конструира модел на нуклеозомата, според който ДНК (146 bp) в Б-образна форма(дясна спирала със стъпка 10 bp) се навива около хистонов октамер, в централната част на който са разположени хистони H3 и H4, а в периферията - H2a и H2b. Диаметърът на такъв нуклеозомен диск е 11 nm, а дебелината му е 5,5 nm. Структурата, състояща се от хистонов октамер и ДНК, навита около него, се нарича нуклеозомна кó ров частици.ДО ó частиците на рова са разделени една от друга чрез сегменти линкерна ДНК. Общата дължина на ДНК сегмента, включен в животинската нуклеозома, е 200 (15) bp.
Хистоновите полипептидни вериги съдържат няколко вида структурни домени. Централният глобуларен домен и гъвкавите изпъкнали N- и С-терминални области, обогатени с основни аминокиселини, се наричат рамене(ръка). С-терминални домени на полипептидни вериги, участващи във взаимодействията хистон-хистон в рамките на ó частиците са предимно под формата на -спирала с разширено централно спирално сечение, по което от двете страни е положена по една по-къса спирала. Всички известни места на обратими пост-транслационни модификации на хистони, които се появяват през целия клетъчен цикъл или по време на клетъчна диференциация, са локализирани в гъвкавите основни домени на техните полипептидни вериги (Таблица I.2). Освен това, N-терминалните рамена на хистоните H3 и H4 са най-запазените региони на молекулите и хистоните като цяло са едни от най-еволюционно запазените протеини. Използване на генетични изследвания на дрождите S. cerevisiae Установено е, че малки делеции и точкови мутации в N-терминалните части на хистоновите гени са придружени от дълбоки и разнообразни промени във фенотипа на дрождените клетки. Това показва изключителното значение на целостта на хистоновите молекули за осигуряване на правилното функциониране на еукариотните гени.
В разтвор хистоните H3 и H4 могат да съществуват под формата на стабилни тетрамери (H3) 2 (H4) 2, а хистоните H2A и H2B - под формата на стабилни димери. Постепенното увеличаване на йонната сила в разтвори, съдържащи естествен хроматин, води до освобождаване първо на H2A/H2B димери и след това на H3/H4 тетрамери.
По-нататъшно усъвършенстване на фината структура на нуклеозомите в кристалите беше извършено наскоро в работата на K. Lueger et al. (1997), използвайки рентгенов дифракционен анализ с висока разделителна способност. Установено е, че изпъкналата повърхност на всеки хистонов хетеродимер в октамера е заобиколена от ДНК сегменти с дължина 27–28 bp, разположени един спрямо друг под ъгъл от 140 o, които са разделени от линкерни области с дължина 4 bp.
В съответствие със съвременните данни, пространствената структура на ДНК като част от ó ровите частици са малко по-различни от B-формата: двойната спирала на ДНК е усукана с 0,25–0,35 bp/завъртане на двойната спирала, което води до образуването на стъпка на спиралата, равна на 10,2 bp/завъртане (в B - форми в разтвор – 10,5 bp/оборот). Стабилност на хистоновия комплекс в състава на ó Образуването на частица се определя от взаимодействието на техните глобуларни части; следователно отстраняването на гъвкавите рамена при условия на лека протеолиза не е придружено от разрушаване на комплекса. N-терминалните рамена на хистоните очевидно осигуряват тяхното взаимодействие със специфични ДНК региони. По този начин N-терминалните домени на хистон Н3 контактуват с ДНК региони на входа на ó първата частица и излиза от нея, докато съответният домен на хистон Н4 се свързва с вътрешната част на ДНК на нуклеозомата.
Изследванията на нуклеозомната структура с висока разделителна способност, споменати по-горе, показват, че централната част на 121-bp ДНК сегмент. в рамките на нуклеозомата образува допълнителни контакти с хистон Н3. В този случай N-терминалните части на полипептидните вериги на хистоните H3 и H2B преминават през каналите, образувани от малките жлебове на съседните ДНК суперспирали на нуклеозомата, а N-терминалната част на хистона H2A контактува с малката бразда на външната част на суперспиралата на ДНК. Взети заедно, данните с висока разделителна способност показват, че ДНК в сърцевината на нуклеозомите се огъва неравномерно около хистоновите октамери. Кривината се нарушава на местата, където ДНК взаимодейства с повърхността на хистона, и такива прекъсвания са най-забележими на разстояния от 10–15 и 40 bp. от центъра на супернамотката на ДНК.