Тази книга е предназначена за студенти от медицински учебни заведения. Това кратко ръководство ще ви помогне да се подготвите и да преминете своя изпит по микробиология. Материалът е поднесен в много удобна и запомняща се форма и ще помогне на студентите за кратко време да усвоят в детайли основните понятия и понятия от дисциплината, както и да конкретизират и систематизират знанията.
* * *
Даденият уводен фрагмент от книгата Микробиология: бележки за лекции (K. V. Tkachenko)предоставена от нашия книжен партньор - фирма Литърс.
ЛЕКЦИЯ № 4. Генетика на микроорганизмите. Бактериофаги
1. Организация на наследствения материал на бактериите
Наследственият апарат на бактериите е представен от една хромозома, която е ДНК молекула, тя е спираловидна и сгъната в пръстен. Този пръстен е прикрепен към цитоплазмената мембрана в една точка. Индивидуалните гени са разположени на бактериалната хромозома.
Функционалните единици на бактериалния геном, в допълнение към хромозомните гени, са:
1) IS последователности;
2) транспозони;
3) плазмиди.
IS последователностите са къси фрагменти от ДНК. Те не носят структурни (кодиращи протеини) гени, а съдържат само гени, отговорни за транспонирането (способността да се движат по хромозомата и да се интегрират в различните й участъци).
Транспозоните са по-големи ДНК молекули. В допълнение към гените, отговорни за транспонирането, те съдържат и структурен ген. Транспозоните са способни да се движат по хромозомата. Тяхната позиция влияе върху генната експресия. Транспозоните могат да съществуват извън хромозомата (автономно), но не са способни на автономна репликация.
Плазмидите са допълнителен екстрахромозомен генетичен материал. Това е кръгла, двуверижна ДНК молекула, чиито гени кодират допълнителни свойства, даващи селективни предимства на клетките. Плазмидите са способни на автономна репликация, т.е. независими от хромозомата или под неин слаб контрол. Благодарение на автономната репликация, плазмидите могат да доведат до феномена на амплификация: един и същ плазмид може да присъства в няколко копия, като по този начин засилва проявата на дадена черта.
В зависимост от свойствата на признаците, които плазмидите кодират, те се разграничават:
1) R-плазмиди. Осигуряват лекарствена резистентност; може да съдържа гени, отговорни за синтеза на ензими, които разрушават лекарствата, може да промени пропускливостта на мембраната;
2) F-плазмиди. Те кодират пола в бактериите. Мъжките клетки (F+) съдържат F плазмид, женските клетки (F-) не съдържат. Мъжките клетки действат като донор на генетичен материал по време на конюгацията, а женските клетки действат като реципиент. Те имат различен повърхностен електрически заряд и следователно се привличат. Самият F-плазмид преминава от донора, ако е в автономно състояние в клетката.
F-плазмидите са способни да се интегрират в клетъчната хромозома и да напуснат интегрираното състояние за автономно състояние. В този случай се улавят хромозомни гени, които клетката може да дари по време на конюгиране;
3) Col плазмиди. Кодира синтеза на бактериоцини. Това са бактерицидни вещества, които действат върху близкородствени бактерии;
4) Токсични плазмиди. Кодира производството на екзотоксини;
5) плазмиди за биоразграждане. Кодират ензими, с които бактериите могат да използват ксенобиотиците.
Загубата на плазмид от клетка не води до нейната смърт. Една и съща клетка може да съдържа различни плазмиди.
2. Изменчивост при бактериите
Има два вида изменчивост - фенотипна и генотипна.
Фенотипната изменчивост - модификации - не засяга генотипа. Модификациите засягат по-голямата част от индивидите в популацията. Те не се предават по наследство и избледняват с времето, т.е. връщат се към първоначалния фенотип.
Генотипната вариация засяга генотипа. Основава се на мутации и рекомбинации.
Мутациите са промяна в генотипа, която продължава в продължение на няколко поколения и е придружена от промяна във фенотипа. Особеността на мутациите в бактериите е относителната лекота на тяхното откриване.
Мутациите се различават по местоположение:
1) ген (точка);
2) хромозомни;
3) плазмид.
По произход мутациите могат да бъдат:
1) спонтанен (неизвестен мутаген);
2) индуциран (мутаген неизвестен).
Рекомбинацията е обмен на генетичен материал между два индивида с появата на рекомбинантни индивиди с променен генотип.
Бактериите имат няколко механизма на рекомбинация:
1) спрежение;
2) сливане на протопласти;
3) трансформация;
4) трансдукция.
Конюгацията е обмен на генетична информация чрез директен контакт между донора и реципиента. Плазмидите имат най-висока честота на предаване и плазмидите могат да имат различни гостоприемници. След образуването на конюгационен мост между донора и реципиента, през него една верига от донорна ДНК навлиза в реципиентната клетка. Колкото по-дълъг е този контакт, толкова повече от донорната ДНК може да бъде прехвърлена на реципиента.
Сливането на протопластите е механизъм за обмен на генетична информация по време на директен контакт на участъци от цитоплазмената мембрана в бактерии без клетъчна стена.
Трансформацията е трансфер на генетична информация под формата на изолирани ДНК фрагменти, когато реципиентната клетка е в среда, съдържаща донорна ДНК. Трансдукцията изисква специално физиологично състояние на реципиентната клетка - компетентност. Това състояние е присъщо на активно делящите се клетки, в които протичат процесите на репликация на собствените им нуклеинови киселини. В такива клетки действа фактор на компетентност - това е протеин, който предизвиква повишаване на пропускливостта на клетъчната стена и цитоплазмената мембрана, така че ДНК фрагмент може да проникне в такава клетка.
Трансдукцията е трансфер на генетична информация между бактериални клетки с помощта на умерени трансдуциращи фаги. Трансдуциращите фаги могат да прехвърлят един или повече гени.
Трансдукцията се случва:
1) специфичен (същият ген винаги се прехвърля, трансдуциращият фаг винаги се намира на едно и също място);
2) неспецифични (предават се различни гени, локализацията на трансдуциращия фаг не е постоянна).
3. Бактериофаги
Фаговите вириони се състоят от глава, съдържаща вирусната нуклеинова киселина, и опашка.
Нуклеокапсидът на главата на фага има кубичен тип симетрия, а процесът има спирален тип, т.е. бактериофагите имат смесен тип симетрия.
Фагите могат да съществуват в две форми:
1) вътреклетъчен (това е профаг, чиста ДНК);
2) извънклетъчен (това е вирион).
Фагите, подобно на други вируси, имат антигенни свойства и съдържат групово-специфични и типово-специфични антигени.
Има два вида взаимодействие фаг-клетка:
1) литична (продуктивна вирусна инфекция). Това е вид взаимодействие, при което възпроизвеждането на вируса става в бактериална клетка. Тя умира в процеса. Първо, фагите се адсорбират върху клетъчната стена. След това идва фазата на проникване. Лизозимът действа на мястото на адсорбция на фага и благодарение на контрактилните протеини на опашната част, нуклеиновата киселина на фага се инжектира в клетката. Това е последвано от среден период, по време на който синтезът на клетъчните компоненти се потиска и възниква дизюнктивният начин на възпроизвеждане на фаги. В този случай нуклеиновата киселина на фага се синтезира в нуклеоидната област и след това синтезът на протеини се извършва върху рибозомите. Фагите, които имат литичен тип взаимодействие, се наричат вирулентни.
В последния период, в резултат на самосглобяване, протеините се нагъват около нуклеиновата киселина и се образуват нови фагови частици. Те напускат клетката, разрушавайки нейната клетъчна стена, т.е. възниква лизис на бактерията;
2) лизогенен. Това са умерени фаги. Когато нуклеинова киселина проникне в клетката, тя се интегрира в клетъчния геном и се наблюдава дългосрочно съжителство на фага с клетката без нейната смърт. Когато външните условия се променят, фагът може да напусне своята интегрирана форма и да развие продуктивна вирусна инфекция.
Въз основа на спецификата се разграничават:
1) поливалентни фаги (лизиращи култури от едно семейство или род бактерии);
2) моновалентни (лизират култури само от един вид бактерии);
3) типичен (способен да причини лизис само на определени типове (варианти) на бактериална култура в рамките на бактериален вид).
Фагите могат да се използват като диагностични лекарства за определяне на рода и вида на бактериите, изолирани по време на бактериологични изследвания. Въпреки това, те се използват по-често за лечение и профилактика на някои инфекциозни заболявания.
тема: Генетика на бактериите1865 Мендел открива съществуването на гени. 1869 Фишър изолира ДНК. След 80 години е доказано, че носител на гени е ДНК, 1953 г. Крик, Уотсън - структурата на ДНК е дешифрирана.
Генът извършва следното осн функции:
Непрекъснатостта на наследяването на генетичната информация поради механизма на репликация на ДНК
Контрол на телесните структури и функции с помощта на генетичен код
Благодарение на мутацията и генетичните рекомбинации, които се случват в гена, се случва еволюцията на всички живи организми.
Триплетен код → кодонът се състои от 3 букви и кодира една аминокиселина
Кодът не се припокрива
Броят на безсмислените кодони е много малък (3 от 64)
Последователността на кодовете в гена определя последователността на аминокиселинните остатъци в полипептидната верига
Кодът е универсален
Способността за самодублиране с помощта на механизма за самовъзпроизвеждане
Самоизразяване (експресия) чрез регулиран синтез на информационна РНК
Самообновяване чрез мутации, рекомбинации и самоподвижни елементи
Самокоригиране (преразглеждане, поправка, потискане)
Гените на вирусите и еукариотите се състоят от екзон (кодиращи) и интрони (некодиращи). При вирусите два гена с различни рамки на четене могат да съществуват в един и същи фрагмент. Генът не винаги е строго ограничен участък от хромозомата; в бактериите има подвижни участъци. Генът изисква регулиране (регулатори, промотори). Генът е единственият носител и пазител на живота, а протеинът определя формата и начина на живот.
Еволюцията на генетичната система върви в посока кодон (триплет) → ген → оперон → геном на вируси и плазмиди → прокариотна хромозома → еукариотна хромозома (ядро).
Размерът на генома на представители на различни живи организми варира значително. Може да се измери в следните единици: молекулна маса на нуклеиновите киселини, или в броя на нуклеотидните двойки, или в броя на гените. Всички тези стойности са сравними; един ген включва средно 1000 нуклеотидни двойки (вирус на хепатит В - 4 гена; ХИВ - 9 гена)
Генотипът е целият набор от гени в даден вид организъм. 10%-70% са некодиращи гени (повтарящи се последователности), те не принадлежат към генотипа и съставляват генома.
Фенотип - външни прояви на генотипа в специфични условия на околната среда, когато външните условия се променят, генотипът се променя, но генотипът остава същият.
^ Характеристики на бактериалната генетика.
Бактериалните хромозоми са разположени свободно в цитоплазмата и не са ограничени от мембрани, но във всички случаи бактериалната ДНК е свързана с рецептори на мембраната.
Бактериите са хаплоидни, съдържанието на ДНК не е постоянно, може да достигне 2, 4, 6, 8 хромозоми (при други организми е постоянно и се удвоява само преди разделяне).
Трансферът на генетична информация се извършва не само вертикално (майка→дъщеря), но и хоризонтално (конюгация, трансформация)
В допълнение към хромозомния геном има нехромозомен генетичен материал, който се нарича плазмиден геном (епизоми, екстрахромозомни фактори на наследствеността). Това придава на клетката допълнителни биологични свойства.
Съдържанието на ДНК в бактериите зависи от техните условия на растеж или от времето на бактериалния клетъчен цикъл, което се случва на всеки 20-30 минути, следователно количеството може да съответства на (4,6,8) и това е придружено от увеличаване на брой рибозоми (етапите на транскрипция и транслация протичат едновременно, способността за регулиране на скоростта на възпроизвеждане е основното условие за запазване на вида.
^ Характеристики на репликацията.
Вегетативна репликация: определя вертикалното предаване на информация, контролирано от хромозомни и плазмидни гени.
Конюгативна репликация: пренасяне на материал хоризонтално и се контролира само от плазмидни гени, докато комплементарната верига на ДНК се завършва от донора към реципиента.
Репаративна репликация: механизъм, чрез който се елиминира повреден участък от ДНК
Структурно-функционална единица е оперон - група структурни гени, свързани със специален операторен ген, той контролира цялата група структурни гени и действа като независима единица, под контрола на модулаторния ген. В една хромозома гените се разпределят един след друг, контролирайки различни процеси, но крайният резултат може да се получи, като не се избира последователно (като свиренето на пиано).
^ Хромозомна карта на бактериите
Ромозомите на бактериите имат пръстеновидна форма, гените са подредени линейно, могат да бъдат подредени последователно. Локализацията на гените се определя в минутите на техния трансфер, а хромозомната карта е 0-100 минути.
Определянето на местоположението на ген върху хромозома се нарича картографиране, а местоположението им е хромозомна карта, чийто мащаб е в минути. В момента има карти: E. coli.
^ Изследване на организацията на бактериалния геном.
Осъществява се с помощта на ензими - рестрикционни ензими, които могат да разцепват ДНК в специфични области, които са комплементарни на тях. Понастоящем са известни повече от 100 рестрикционни ензима. Използвайки ги, можете да получите ДНК рестрикционни фрагменти → рестрикционен анализ. Сравнението на рестрикционни фрагменти се нарича рестрикционен анализ, който може да се използва за идентификация. Правят се копия на ДНК вериги, които имат лепкави краища, с които фрагментите могат отново да образуват пръстени. Благодарение на лепкавите краища може да се получи рекомбинантна ДНК между различни ДНК фрагменти. Ако тези фрагменти са получени с помощта на един и същ рестрикционен ензим, те могат да взаимодействат един с друг.
Метод на клониране. Изолираният ДНК фрагмент се въвежда в самовъзпроизвеждаща се генетична структура с помощта на рекомбинантни молекули - в плазмид, вирус, след което те служат като вектор за клониране. Те са зашити с фрагмент от ДНК - геном, който ще се размножи като част от плазмил или като част от генома на бактериална клетка. Такава хибридна ДНК може също да бъде изолирана от клетка чрез рестрикция - изрязване. Клонирането може да произведе голям брой копия на всяка част от ДНК, която може да бъде радиоактивно маркирана.
Метод на сегвинация. Местоположението на ДНК в клонирания ДНК фрагмент се използва за определяне на последователността. Методите за секвениране и клониране са методи, които помагат за изследване на геноми, включително човешкия геном (2004).
^ Плазмиден геном на бактериална клетка.
Плазмидите са ДНК фрагменти с малко молекулно тегло, които носят от 40 до 50 гена. Те също така изпълняват регулаторни и структурни функции. Плазмидите могат да бъдат разположени или в цитоплазмата, или да имат пръстеновидна структура. Хромозомите могат да бъдат в интегрирано състояние (епизоми).
Свойства на плазмидите:
Незадължителни генетични елементи на бактерии (по избор).
Те имат самовъзпроизвеждане и автономност, независимост от клетъчната хромозома. Не се контролира от бактериална ДНК.
Те са склонни към предаване както вертикално, така и хоризонтално, като същевременно осигуряват хегетична променливост на бактериите.
F-факторът е пръстеновидна молекула. Неговите гени кодират образуването на генитални въси, размножаването на бактериите, скоростта на възпроизвеждане е свързана с конюгацията, участва в хоризонталния трансфер на генетичен материал и се предават различни свойства: резистентност към антибиотици, лактозна позитивност.
R-фактор – определя производството на ензима β-лактамаза → резистентност към антибиотици. Този плазмид може да съдържа специален тра-оперон (ген, отговорен за трансфера) → плазмидът се трансферира лесно.
Hly – плазмидът е свързан с производството на хемотоксин → по-токсигенни бактерии.
Факторът Col е отговорен за производството на колицини (вещества, подобни на антибиотици), които осигуряват на бактериите предимство пред останалите.
Плазмиди за биоразграждане: участват в разграждането на замърсителите на околната среда.
Плазмидът на умерен фаг е фаг, който е в състояние да разпознае и нахлуе в клетка, но не може да причини лизиране на бактерии. Може да напусне клетка, да улови част от генетичния материал на клетката и, когато бъде въведен в друга клетка, да участва в трансфера на генетичен материал (трансдукция)
Плазмидите биват конюгативни (способни на трансфер, съдържащи трансферен ген) и неконюгативни (не участват в рекомбинация). По отношение на съвместимостта има такива, които са несъвместими помежду си и такива, които са съвместими.
^ Transpasons, IS последователности.
Отнася се за допълнителни генетични елементи
Th-малки участъци от ДНК (скачащи) - може да съдържа R гени. Те могат да бъдат открити както в ДНК, така и в плазмидите. Транспазоните са свързани с мутации в бактериите, защото могат да се движат и да причинят мутации като делеция, инверсия, дублиране. Транспазоните са ограничени от двете страни от IS последователности.
IS фрагментите са малки ДНК фрагменти, които се повтарят и не могат да се възпроизвеждат в свободно състояние; те не участват. Основни функции: регулаторни (способни да включват или изключват ген). Те координират взаимодействието на транспазоните на плазмидите и фагите както помежду си, така и с хромозомата на клетката гостоприемник.
^ Изменчивост на бактериите.
Модификация: адаптивна реакция на организмите в отговор на условията на околната среда. Може да промени морфологични, културни, ензимни свойства.
Генотипен: засяга генотипа на клетката:
Мутационен - промяна в първичната структура на ДНК, може да бъде свързана със загуба на нуклеатиди, делецията може да има характер на инверсия. Може да бъде хромозомен или плазмиден. Може да бъде спонтанен или индуциран. Смисълът на еволюционната промяна е придружен от селекция.
Комбинативен: трансформация– трансфер на генетичен материал под формата на ДНК разтвор от донора към реципиента, трансдукция– трансфер на генетичен материал от донор към реципиент с помощта на умерени фаги (неспецифични, специфични), конюгация – трансфер на генетичен материал от донор с F фактор към реципиент през гениталните вили с образуването на нови щамове.
Характеристики на генетиката на вируса.
Молекулното тегло на вирусния геном е с 10 6 по-малко от масата на еукариотната клетка.
Организацията на генетичния апарат е същата
Гени от няколко единици до десетки.
Принципът 1 ген - РНК молекули - 1 протеин във вирусната ДНК е нарушен и вирусната иРНК може да насочва синтеза на 2 или повече протеина.
Двойно четене на една и съща РНК, но от различен кодон.
Преместване на рамката на излъчване
Сплайсинг (изрязване на интрони)
Транскрипция от припокриващи се региони на нуклеинова киселина → границите на гена се размиват и концепцията за ген придобива функционално значение.
Модификация. Вирусите се определят главно от клетката гостоприемник. Модификацията засяга суперкапсида.
Генотипна. Мутация, тоест промяна в първичната структура на нуклеотидите.
Рекомбинативен. Възниква при едновременно заразяване на клетка гостоприемник с два или повече вируса, обмен на гени → образуват се рекомбинантни щамове вируси, които съдържат гени от 2 или повече щама.
^ Генетично реактивиране . Процесът, чрез който вирионите се допълват взаимно поради преразпределението на гените по време на тяхната репликация. Това се наблюдава при вируси с фрагментиран геном. При кръстосването на такива вируси се образуват пълноценни единици.
Допълване(допълнение). Не генетичнопроцес, при който вирусът доставя на своя партньор (обикновено дефектен) липсващите протеинови компоненти, а не нуклеинови киселини. Характерно за много вируси - аденовирусите могат да се култивират само в присъствието на вируса SV 40. Вирусът на хепатит В е помощник на δ вируса (HDV).
^ Фенотипно смесване . Наблюдава се, когато два вируса се култивират съвместно, че геномът на единия вирус се съдържа в капсида на другия вирус. Генотипът не се променя
^ Генно инженерство.
Биотехнологията е използването на биологични обекти (клетки от микроорганизми, гъби, животни, хора) за получаване на полезни за хората продукти, които не могат да бъдат получени по друг начин. Основното направление е генното инженерство. Появява се през 1972 г., когато се появява първата работа по генно инженерство.
Обект на генното инженерство: ген или група от гени.
Източници: вируси, прокарилиди
Цел: трансплантация на ген в други, хетерогенни системи, експресия на този ген и др. получават здравословни продукти (протеини, ензими, хормони, лекарства и други биологично активни вещества)
Инструмент за генно инженерство: Ензими рестрикционни ензимис които можете да получите фрагменти от генома. Рестрикционните ензими имат лепкави краища, за да свързват различни гени заедно. Ако не се използват лигази.
Етапи на генното инженерство:
изолиране на ген от клетка с помощта на рестрикционни ензими от клетъчния геном.
прикрепване на ген към вектор (носител) - плазмид, ДНК, РНК, умерени фаги, изкуствени плазмиди. Основните изисквания към вектора са той да изпълнява ролята на самовъзпроизвеждане. Този етап е придружен от образуването на рекомбинантна ДНК (ген + вектор)
въвеждане на рекомбинантна ДНК в хетерогенна система. Тази система е прокариотна, еукариотна и соматична клетка.
експресия на въведения ген, се създават условия рекомбинантната молекула да започне да се самовъзпроизвежда и да принуди клетката да произведе вещество, което кодира пренесения ген.
генно клониране и изолиране на продукта, пречистване на продукта и добив на продукта
Генетиката на микроорганизмите като наука
Бележка 1
Приблизително до края на 30-те години на миналия век се смяташе, че микроорганизмите нямат ядрен апарат. Следователно въпросите за наследствеността и изменчивостта на микроорганизмите не са внимателно проучени.
Едва с изобретяването на електронния микроскоп стана възможно да се изследва субмикроскопската структура на клетките като цяло и на микроорганизмите в частност.
От началото на 40-те години на миналия век генетиците насочват вниманието си към микроорганизмите. Бактериите, микроскопичните гъби и вирусите стават обект на генетични изследвания. Формира се нов клон на микробиологията – генетиката на микроорганизмите.
Генетиката на микроорганизмите е раздел от общата генетика, в който се изучават микроорганизмите (бактерии, вируси, микроскопични гъби) и особеностите на тяхната наследственост и променливост.
Характерна особеност на микроорганизмите е хаплоиден набор от хромозоми или кръгова ДНК молекула. Това прави възможно появата на мутации в първото поколение потомци.
Начало на микробиологичните генетични изследвания
Благодарение на изследването на субмикроскопичната структура на микробните клетки беше възможно да се намерят отговори на много генетични въпроси. American Genetics O.T. Ейвъри, К. Маклауд и М. Маккарти, провеждайки експерименти с пневмококи, получават първите доказателства, че материалният носител на наследствеността е молекулата на ДНК. Изследванията върху плесента по хляба позволиха да се формулира позицията, че един ген програмира синтеза на една полипептидна верига (един протеин).
Но те започнаха да изучават микроорганизмите особено интензивно от гледна точка на генетиката, след като американските микробиолози С. Лурия и М. Делброк, използвайки примера на Escherichia coli, доказаха универсалността на моделите на мутационния процес. Те доказаха, че бактериите също се подчиняват на мутационни закони.
В науката се появи нов принцип за изследване на изменчивостта на бактериите - клонов анализ. Това включва задълбочено изследване на потомството на една клетка. Тази клетка става прародител на клонинга.
Изследване на бактерии
В резултат на усърдни изследвания американските генетици J. и E. Lederberg успяха да докажат, че мутациите възникват в бактериите независимо от условията на тяхното култивиране. Те разработиха метода за пръстови отпечатъци, който направи възможно значително да се опрости селекцията на микроорганизми с желани свойства за по-нататъшни изследвания. Те доказаха, че в големи популации от бактериални клетки мутациите възникват по хаотичен начин - спонтанно.
През 1946 г. е доказано, че бактериите имат и полов процес; открити са феномените на хромозомна конюгация и генна рекомбинация, прехвърляне на генетична информация от една бактериална клетка към друга чрез бактериофаг.
Има мнение, че в кръговата молекула на нуклеиновата киселина на прокариотните клетки "четенето на информация" зависи от мястото, където започва "четенето". В зависимост от това с кой нуклеотид е започнал този процес, се определя синтезата на един или друг протеин.
Изследване на фаги
Докато изучават особеностите на връзката "бактерия-бактериофаг", американски генетици откриват феномена на трансдукцията (трансфер на гени между бактериални клетки с помощта на фаги) и откриват рекомбинация във фагите. Това направи възможно изучаването на въпросите на наследствеността на молекулярно ниво (молекулярно ниво на организация на материята).
Германски микробиолози изследваха молекулата на РНК. За всяка група микроорганизми е разработена методика за изследване.
Генетика на гъби и водорасли
Нисшите гъби и водорасли имат полов процес, малко по-различен от половия процес на други организми. Благодарение на тяхното изследване се появи нов метод - тетраден анализ. Докато изучавали тези организми, учените разработили техника за комбиниране на ядрата на генетично различни щамове микроорганизми. Всички тези методи могат по-нататък да послужат за отглеждане на организми с дадени качества, за разработване на нови поколения антибиотици и биологично активни вещества, както и за борба с много видове болести по растенията, животните и, разбира се, хората.
Бележка 2
Но въпросите на генното инженерство изискват внимателен подход към изучаването и прилагането на получената информация на практика. В крайна сметка не е ясно до какви последствия може да доведе появата на генетично модифицирани организми в природата и в човешкото тяло.
Съдържание на темата "Оценка на бактериалния растеж. Спорулация от бактерии. Генетика на бактериите.":1. Двуфазен растеж на бактериите. Диауксия. Растеж без разделяне. Оценка на бактериалния растеж. Количествена оценка на бактериалния растеж.
2. Фактори, влияещи върху растежа на бактериите. Хранителна среда за бактериален растеж. Прости и сложни културни среди. Твърда и течна хранителна среда.
3. Температура на бактериален растеж. Мезофилни бактерии. Термофилни бактерии. Психрофилни бактерии. Аериране на бактерии.
4. Стойността на pH, необходима за растежа на бактериите. Бактериални пигменти. Видове пигменти. Функции на бактериалните пигменти.
5. Спорообразуване от бактерии. Бактериални спори. Спорангии. Ендоспори. Екзоспори.
6. Морфология на бактериалните спори. Структурата на бактериалната спора. Структура на бактериална спора.
7. Спорообразуване на бактерии. Етапи на спорулация при бактерии. Местоположение на спорите в бактериите.
8. Покълване на бактериални спори. Активиране на спори. Спящи (некултивирани) форми на бактерии.
10. Екстрахромозомни фактори на бактериалната наследственост. Бактериални плазмиди. Видове плазмиди. Функции на бактериалните плазмиди.
В наши дни молекулярната биология може да се счита за приоритетна област на естествените науки. Тя е тясно свързана с микробиологията и в известен смисъл е нейно рожба, тъй като използва бактерии и вируси като свои основни модели, а една от основните области на молекулярната биология е молекулярната генетика- дълго време не беше нищо повече от генетиката на бактериите и бактериофагите.
Учене генетика на бактериитеТой също така има несъмнен приложен интерес, например по отношение на установяването на механизмите на предаване на патогенни свойства и лекарствена резистентност.
Бактериите са удобен модел за генетични изследвания. Те се отличават с: относителната простота на структурата на генома, което прави възможно идентифицирането на мутанти с честота 10 -9 и по-ниска; хаплоидност, с изключение на феномена на доминиране; полова диференциация под формата на донорни и реципиентни клетки; наличието на отделни и интегрирани ДНК фрагменти (плазмиди, транспозони и др.); лекота на култивиране и възможност за получаване на популации, съдържащи милиарди микробни тела.
Подобно на други организми, съвкупността от гени в бактериалната клетка е геном- определя неговите свойства и характеристики ( генотип). Фенотип на бактериална клетка- резултат от взаимодействията между бактерията и околната среда - също контролира генома (тъй като самите характеристики са кодирани в бактериалните гени).
Генетичен материал на бактерии
Ядрени структури на бактерииимат характерна структура, която ги отличава от ядрата на еукариотните клетки; те се образуват от така наречените хроматинови тела или нуклеоиди, лишени от обвивка и включващи почти цялата бактериална ДНК.
Ядрени структуримогат да се наблюдават под фазово-контрастен микроскоп, където изглеждат като по-малко плътни области на цитоплазмата. За идентифицирането им във фиксирани цитонамазки беше предложена реакцията на Feulgen-Rossenböck.
В растящи бактериални клетки нуклеоидиактивно се делят, броят им понякога достига 2-4.
Прокариотен геном
U бактерииобикновено има един затворен пръстеновидна хромозома, съдържащ до 4000 отделни гени, необходими за поддържане на жизнената активност и възпроизводството на бактериите, т.е. бактериалната клетка е хаплоидна и удвояването на хромозомата обикновено се придружава от нейното разделяне.
Някои видове (напр. Brucella melitensis) съдържат стабилно две пръстенови хромозоми, други (Leptospira interrogans) - една кръгова хромозома и един голям плазмид, други - една линейна хромозома (Streptomyces ambofaciens), тоест имат сложни геноми.
Бактериална хромозомасъдържа до 5*106 базови двойки. За сравнение: геномчовек е 2,9 * 10 9 базови двойки. Дължината на бактериалната хромозома в разгънато състояние е около 1 mm (Escherichia coli).
Някои бактериисъдържа екстрахромозомни ДНК молекули ( плазмиди) и преносими елементи (или плазмидни, или хромозомни).
ТЕМА НА ЛЕКЦИЯТА: "Генетика на бактериите."
Конспект на лекцията:
Генетиката като наука. История на формирането на генетиката на микроорганизмите.
Организация на генетичния апарат на бактериална клетка.
Екстрахромозомни фактори на наследствеността.
Концепцията за генотип и фенотип, видове променливост.
Генетикае наука, която изучава закономерностите на наследствеността и изменчивостта на живите организми, включително микроорганизмите.
Наследственост- това е свойството на жив организъм (включително микроорганизъм) да предава на своето потомство характеристиките и характеристиките на развитие на своите родители (видови характеристики).
Променливост– това е свойството на живия организъм (включително микроорганизма) да се променя (променя видовите характеристики), осигурявайки разнообразие на живите същества както на ниво отделна клетка, така и на ниво вид.
Исторически етапи в развитието на генетиката на микроорганизмите.
0. Евристичен (преднаучен) период.
Според археологически доказателства, преди 6000 години, надписи върху глинени плочки гласят: „физическите характеристики могат да се предават от едно поколение на друго“; по-специално вавилонските глинени плочки показват възможни черти при кръстосване на коне, подобряване на породата на други животни и сортове растения.
аз. Емпиричен (научен) период(средата на 19 век) .
Отправна точка за развитието на генетиката като наука са трудовете на Г. Мендел. IN 1865 гавстрийски монах Грегор Менделпубликувани работи за кръстосване на сортове грах: „наследствените характеристики не се смесват, а се предават от родители на потомци под формата на отделни (дискретни) единици.“ Тези произведения обаче бяха толкова по-напред от развитието на биологията от онова време, че се оказаха непотърсени.
Въпреки това, корените на бактериалната генетика идват от първите опити за бактериална таксономия. Работите на Л. Пастьор и Р. Кох подтикнаха откриването на нови микроорганизми, беше необходимо да ги систематизираме, т.е. да сравним сходни характеристики и различия. И тук мненията на учените са разделени. Имаше мнение полиморфисти (плеоморфисти)който вярва, че всички свойства на бактериите се променят и мономорфистикойто твърди, че свойствата на микроорганизмите са непроменени. След дълга дискусия плеоморфистите спечелиха и резултатите от почти вековен спор между двете направления послужиха за основа на генетиката на бактериите.
II. Класически период(началото на 20 век) .
IN 1900 г. К. Коренс, Е. фон Чермак, Г. Де Врисв работите по хибридизацията на бактериите бяха преоткрити законите на Мендел, които бяха забравени дотогава. От този момент започва бързото развитие на генетиката на висшите организми (растения, животни).
IN 1903 Йохансенпредложи термина "ген".
IN 1906 Бетсъндаде определение за "генетика".
IN 1925 Надсон, Филиповизследва ефекта на рентгеновите лъчи върху дрождите, в 1927 г. термичните мутации са изследвани.
IN 1928 г. Фредерик Грифитсоткриха наследствена молекула, която се предава от бактерия на бактерия.
III. Период на молекулярната генетика(от средата на 20 век) .
Основните открития в бактериалната генетика се случиха в средата на 19 век, когато учените имаха възможност не само да систематизират информацията за променливостта и наследствеността, но и да дешифрират техните „фини“ механизми. През този период са дешифрирани структурата на ДНК и триплетният код, описани са механизмите на протеиновия синтез, открити са рестрикционни ензими и е извършено секвениране на ДНК.
IN 1944 О. Ейвъри, К. Маклауд, М. Маккартиизолират ДНК чрез трансформиране на капсулни пневмококи в капсулни пневмококи in vitro, като по този начин доказват, че материалната единица на наследствеността (генетичен материал) в бактериите е ДНК.
IN 1952 Преследванедоказва, че генетичната информация на бактериофагите се съдържа и в ДНК.
IN 1953 Ф. Крик, Д. Уотсънмоделира структурата и репликацията на ДНК и обосновава приложимостта на този модел към наследствеността и изменчивостта на микроорганизмите.
IN 40-50 години– идентифицирани са системи за рекомбинация в бактериите: трансдукция, трансформация и конюгация. Тогава са открити екстрахромозомни фактори на наследствеността: плазмиди, транспозони, Is елементи и др.
IN 1958 Щалдоказа, че дублирането на ДНК в бактериите е полуконсервативно.
IN 1961 Ф. Крик, Бърнет и Д. Уотсънформулира общи принципи на организацията на генетичния код, използвайки примера на генетичния код на Е. coli (кодът е триплетен, изроден и не се припокрива).
IN 1970 гВ грипните бактерии са открити рестрикционни ензими.
IN 1977 г. Лаборатория Sangerнапълно секвенира генома на бактериофага.
IN 1983 Кери Мелисотваря PCR за проста и бърза амплификация на ДНК.
IN 1995 гГеномът на невирусен организъм, бактерията Haemophylus influenzae, е напълно секвениран.
IN 1996 гЗа първи път е секвениран геномът на хлебната мая (Saccharomyces cerevisiae).
IN 1998 гГеномът на многоклетъчен организъм, нематода, е секвениран.
IN 2001 гНаправени са първите „скици“ на пълната последователност на човешкия геном.
IN 2003 г 99% от човешкия геном е секвениран.
В момента се развива биотехнология, инженерна ензимология- използване на микробни ензими върху носител (разработен е имобилизиран стрептокиназен препарат - "стрептодеказа", който се въвежда в съд за разтваряне на кръвен съсирек; водоразтворима полизахаридна матрица с прикрепена стрептокиназа повишава стабилността на ензима, намалява неговата токсичност, алергичен ефект и повишава способността за разтваряне на кръвни съсиреци). Развива се с бързи темпове клетъчно инженерство(хибридоми), тъканно инженерство(метод за получаване на кератоноцити), генно инженерство(получен е индустриален щам на суперпродуциращ микроорганизъм, който синтезира аминокиселината „треонин” за добавяне към храната на животните с цел изграждане на мускулна тъкан).
Недостатъци на висшите организми като модели за генетични изследвания:
продължителност на експеримента (дълъг живот на опитното животно);
ограничен брой индивиди, използвани в експеримента;
диплоиден набор от хромозоми;
изисквания за грижа и специална поддръжка на животните;
икономически разходи.
структура на наследствеността, подобна на висшите организми - ДНК;
способността за получаване на популации, съдържащи милиарди микробни клетки за кратко време;
хаплоиден набор от хромозоми (изключва феномена на доминиране и ви позволява да откривате мутации с висока честота);
наличието на автономни и интегрирани ДНК фрагменти (плазмиди, транспозони, Is елементи и др.);
полова диференциация под формата на донорни и реципиентни клетки.
Организация на генетичния апарат на бактериална клетка.
Материална единица на наследствеността, което определя генетичните свойства на всички живи организми, включително бактерии и вируси (с изключение на РНК вирусите), е ДНК.
Хромозома на бактериална клеткапредставлява кръгова двойноверижна ДНК молекула, организирана в нуклеоид.
ДНК молекулабактериите, подобно на други организми, са дълги двойни вериги от мономери - нуклеотиди. Всеки мононуклеотидсъдържа една от азотните основи (аденин/гуанин, цитозин/тимин), една захарна молекула (дезоксирибоза) и остатък от фосфорна киселина. Нуклеотидите в ДНК са свързани помежду си чрез фосфодиестерни връзки. Образуват се мононуклеотиди полинуклеотиди, и тези вериги ДНК. Две полинуклеотидни вериги, усукани в правилни разклонения около обща ос, са свързани една с друга водородни връзки, които се установяват между пуриновата база на едната верига и пиримидиновата база на другата (аденинът от едната верига се свързва с тимина на другата, а гуанинът с цитозина). В същото време общото съотношение A+T/G+C е постоянна стойност за всеки вид микроорганизъм ( Правилото на Чаргаф) и варира от 0,45 до 2,73.
Информация за видовите характеристики и свойства на бактериите се съдържа в гените.
гене част от ДНК молекула, която носи информация за първичната структура на протеин или РНК полипептид.
Наричат се гени, които носят информация за ензими или структурни протеини, синтезирани от микроорганизми структурен. Наричат се гени, които регулират функционирането (транскрипцията) на структурните гени регулаторен(регулаторни елементи - оператори, промоутъри, регулатори).
Доскоро се смяташе, че генната последователност е непрекъсната. Проучванията обаче показват, че той може да бъде прекъснат от нетранслирани региони, осеяни в него ( интрони). Съответно, един ген може да се състои от отделни фрагменти, които са свързани заедно по време на генната експресия. Така структурата на гена е по-сложна, отколкото се смяташе досега.
Разлика между генома на прокариотите и генома на еукариотите.
| Прокариоти | Еукариоти |
| ДНК не е ограничена до ядрената мембрана (разположена свободно в цитоплазмата) | ДНК е ограничена от ядрената мембрана |
| ДНК е свръхнавита | ДНК не е свръхнавита |
| Кръгова ДНК (затворена в пръстен) | Линейна ДНК |
| Не съдържа хистонови протеини | Съдържат хистонови протеини |
| Хаплоиден набор от хромозоми | Диплоиден набор от хромозоми |
| Двойно делене | Разделяне чрез митоза |
| Наличие на отделни ДНК фрагменти (плазмиди, транспозони, Is елементи и др.) | Липса на изолирани ДНК фрагменти |
| Трансфер на генетична информация както вертикално (от клетката майка към дъщерните клетки), така и хоризонтално (от клетката донор към клетката реципиент) | Трансфер на генетична информация само вертикално (от родители към деца) |
Характеристики на репликацията на бактериална ДНК.
Репликация- Това е възпроизвеждането на ДНК чрез самоудвояване.
Репликацията на ДНК при бактериите започва в строго определена точка на хромозомата ( локус– oriC), е полуконсервативен, върви едновременно в две противоположни посоки и също завършва в строго фиксирана точка ( крайна станция).
Етапи на репликация на ДНК:
Разрязване на ДНК молекула с ензим рестрикционни ензими.
Размотаване на ДНК вериги, включващи изомеразии тяхното разделение хеликазис образуването на репликаторна вилка.
Стабилизиране на едноверижни ДНК участъци ДНК свързващ протеин.
Всяка от спиралите се превръща в матрица, върху която ДНК молекулата е завършена според закона за допълване на базовите двойки:
Характеристика на репликацията на ДНК е необходимостта от посевен– къси фрагменти от РНК, които се синтезират с помощта на ДНК праймаси;
Репликацията на ДНК се извършва с помощта на ензим ДНК полимерази, който синтезира ДНК само в посока 5" → 3" и тъй като ДНК веригите са антипаралелни, репликацията се извършва по уникален начин: върху една от шаблонните вериги („водещ“)Синтезът на ДНК протича непрекъснато, а от друга („изоставащ“)ДНК полимеразните вериги трябва да се върнат, за да растат веригата също в посока 5" → 3", така че репликацията се извършва периодично, на къси фрагменти (≈1-2 хиляди нуклеотидни двойки, кръстени на учения, който ги е открил фрагменти от Оказаки) – секцията за праймер на РНК се изрязва с помощта на ендонуклеазии се заменя със сегменти на Okazaki, като ги зашива с помощта на шаблонната ДНК лигаза.
Одит ДНК полимеразановосинтезирани ДНК фрагменти (за да се изключи погрешно включване на нуклеотиди).
Екстрахромозомни фактори на наследствеността.
Екстрахромозомни фактори на наследственосттаса част от много микроорганизми, особено бактерии. Представени са плазмиди и мигриращи елементи –Е-последователности, транспозони (Tn), конюгативни транспозони (CTn), интегрони (в), генни острови (GO) и бактериофаги, които са ДНК молекули, които се различават една от друга по молекулно тегло, количество информация, кодирана в тях, способност за независима репликация и други характеристики. Те не са жизненоважни елементи за бактериалната клетка, тъй като не носят информация за синтеза на ензими, участващи в пластичния или енергийния метаболизъм, но могат да придадат определени селективни предимства на бактериите, например резистентност към антибиотици.
Плазмиди- това са автономни кръгови молекули на двойноверижна ДНК с молекулно тегло, по-малко от това на нуклеоида (размерите варират от 1,5 до 200 mD = 10 3 -10 6 нуклеотидни двойки), способни на самовъзпроизвеждане.
Спонтанна/предизвикана загуба на плазмиди се нарича елиминиране.
Особености:
саморегулираща се репликация;
феноменът на повърхностно изключване (те не позволяват на друг свързан плазмид да навлезе в клетка, която вече съдържа плазмид);
феноменът на несъвместимост (два тясно свързани плазмида не могат стабилно да съществуват съвместно в една и съща клетка);
контрол на броя на плазмидните копия на клетъчна хромозома (осъществява се от собствените репликационни гени на плазмида);
контрол на стабилното запазване на плазмидите в клетката;
контрол на равномерното разпределение на дъщерни плазмиди в дъщерни бактериални клетки;
способността за самопренасяне в конюгирани плазмиди;
способността да се мобилизира за трансфер от неконюгирани плазмиди (способността да се трансферира само в присъствието на трансмисивни плазмиди, използвайки техния апарат за конюгиране);
способността да се даде на клетката допълнителни важни биологични свойства, които насърчават оцеляването на бактериите.
регулаторни (компенсират смущенията в метаболизма на ДНК на бактериалната клетка, регулират самовъзпроизвеждането, контролират самопренасянето или мобилизирането за самопренасяне и други функции на самия плазмид);
кодиране (въвеждане на нова информация в бактериалната клетка, придавайки й допълнителни свойства).
По молекулно тегло:
големи (1-2 на клетка);
малки (до 30).
конюгативен (трансмисивен);
неконюгативни (мобилизируеми).
Съвместимост в една клетка:
съвместим;
несъвместими (тясно свързани).
Според фенотипното проявление на признака:
криптичен (скрит);
некриптичен.
Според детерминистичен критерий:
R-плазмиди (от англ. съпротива– противодействие, съдържат гени – r-гени, отговорни за лекарствената резистентност).
с промяна в пропускливостта на повърхностните структури на бактериалната клетка към антибиотици;
със синтеза на ензими, които разрушават или модифицират антибиотици (β-лактамази, ацетилиране на хлорамфеникол).
Бактериоциногенни плазмиди (например плазмидът Col в Е. coli съдържа гени, отговорни за синтеза на бактериоцини).
За разлика от други плазмиди, факторите на бактериоциногенност са по-рядко интегрирани в хромозомата, рядко се елиминират и много от тях нямат конюгиращи свойства.
F-плазмид (сексуален фактор/фактор на плодовитостта, съдържа гени, които контролират конюгацията).
| Състояние на F-плазмида в клетката | Обозначаване на бактериална клетка |
| офлайн | F+-донор |
| интегриран в хромозомата | Hfr донор |
| в автономно състояние с фрагменти от хромозомна ДНК | F "-донор |
| отсъства от клетката | F – -получател |
Плазмиди за биоразграждане (носят информация за използването на определени органични съединения, които бактериите използват като източници на въглехидрати и енергия, например урологичните щамове на Е. coli съдържат плазмид за хидролиза на урея).
транспозони (Tn-елементи)– нуклеотидни последователности, включващи 2000-20500 нуклеотидни двойки. Състав – ДНК фрагмент (специфичен, носещ гени) и два крайни Is елемента. Те могат да бъдат в свободно състояние под формата на пръстеновидна молекула.
Особености:
не е способен на независима репликация (възпроизвеждане), само като част от хромозоми;
носят генетичната информация, необходима за транспониране (движение);
всеки транспозон съдържа гени, които въвеждат характеристики, важни за бактериите (резистентност към антибиотици, образуване на токсини и др.);
съдържат гени, които определят фенотипните черти (по-лесни за идентифициране).
способни да преминават от един репликон (хромозомна ДНК) към друг (плазмиди, хромозома на друга бактерия, бактериофаг) и обратно: когато са включени в ДНК, те причиняват дублиране, а когато се преместват, делеции и инверсии;
регулаторен;
кодиране.
Особености:
не се репликират сами;
не кодират разпознаваеми фенотипни черти;
индуциране на мутации като делеция (загуба на нуклеотиди) или инверсия (завъртане на ДНК секция с 180 0) по време на движение и дублиране (повторение на ДНК секция), когато се вмъкне в хромозома;
координация на взаимодействията на плазмиди, транспозони и профаги (между тях и бактериалната хромозома).
Концепцията за генотип и фенотип, видове променливост.
Генотипе набор от гени, които определят способността на микроорганизмите за фенотипно проявление на някоя от техните характеристики.
Има истински генотип и плазмен тип.
Истински генотип– набор от гени, концентрирани в бактериалната хромозома и отговорни за проявата на жизнените признаци и свойства.
Плазмотип– набор от екстрахромозомни гени, локализирани в плазмиди и транспозони и отговорни за нежизнените характеристики и свойства, но даващи определени предимства пред други индивиди от популацията (резистентност към антибиотици).
Фенотип– това е съвкупността от всички външни и вътрешни признаци на микроорганизмите, които се проявяват при дадени условия и в даден момент.
Ненаследствена (модификация, фенотипна) изменчивост– това са временни ненаследствени промени в белези или свойства, които не засягат генотипа (не са придружени от промени в първичната структура на ДНК) и възникват под въздействието на фактори на околната среда.
Модификационната променливост не играе съществена роля в еволюцията на бактериите, тъй като не води до появата на нови видове. По същество това е адаптивна (адаптивна) реакция на бактериите към променящите се условия на околната среда, което им позволява бързо да се адаптират и поддържат размера на популацията. Външно модификациите най-често се проявяват като промени в морфологичните и биохимичните свойства. Когато факторът, причинил промените, бъде елиминиран, бактерията се връща към първоначалния си фенотип.
Например:
Способността на патогенните бактерии под въздействието на пеницилин или лизозим да образуват L-форми, които нямат клетъчна стена, което е мишена за пеницилина. След елиминирането на пеницилина, L-формите се връщат към първоначалния си фенотип – започват да синтезират клетъчната стена.
Редица учени смятат дисоциациите за стандартни прояви на модификационна променливост.
Дисоциации(от англ дисоциация– разделяне) е уникална форма на модификационна променливост, проявяваща се в образуването на различни видове колонии върху твърди хранителни среди под въздействието на неблагоприятни фактори (неоптимална температура, pH, стареене на културата, действие на серуми и бактериофаги и др. ).
Това явление е характерно предимно за ентеробактерииа основата на дисоциациите са мутации, което води до загуба на гени, които контролират синтеза на LPS странични вериги в клетъчната стена на Грам-отрицателни бактерии.
С- колонии(от англ гладка– гладка, равномерна) – изпъкнала, правилна кръгла форма с равен ръб и гладка повърхност;
М- колонии(от лат. мукоиден– лигавица) – лигавица, вискозна консистенция, често с концентрични пръстени на повърхността;
г- колонии(от англ джудже– джудже) – джудже, малки дъщерни колонии около основната;
Л- колонии(на името на Lister) - микроскопични колонии с деликатен дантелен ръб и център, изтеглен в средата, често кафяво-жълт на цвят;
Р- колонии(от англ груб– грапава, неравна, неравна) – неправилна форма с неравен, назъбен ръб и грапава, назъбена, набръчкана повърхност, суха, ронеща се.
Значение на дисоциациите: R-формите са по-устойчиви на факторите на околната среда.
Наследствена (генотипна) изменчивост– това са промени във фенотипа, придружени от промени в структурата на генотипа (първична структура на ДНК) и предавани по наследство.
Генотипната променливост не се връща към първоначалния фенотип след елиминиране на влияещия фактор и играе важна роля в еволюцията на бактериите (появата на нови видове). Основата на генотипната изменчивост е мутацииИ рекомбинация.
Мутации(от лат. мутация– промяна) – промени в първичната структура на ДНК, проявяващи се чрез наследствено фиксирана загуба или промяна на някакъв знак или свойство. Мутациите водят до смъртта на 90-95% от клетките в популацията, но оцелелите клетки придобиват предимства пред останалите клетки в популацията.
Факторите, водещи до мутации, се наричат мутагени.
Видове мутагени:
физически (UVL, температура, магнитни полета, ултразвук, йонизиращо лъчение);
химически (акридинови и анилинови багрила, аналози на азотни основи - азотна киселина, нитрофурани, нитрозосъединения - нитрозогуанидин, нитрозокарбамид и др.);
биологични (бактериофаги, фитонциди, антибиотици - саркомицин).
По произход:
спонтанни - възникват без видима намеса отвън, т.е. мутагенният фактор остава неидентифициран (честота ≈ 1:10 6 -10 9);
индуцирани - възникват под въздействието на различни известни мутагени.
нуклеоид (ядрен);
цитоплазмен (плазмид).
Според броя на мутиралите гени и естеството на промените в първичната структура на ДНК:
ген (точка) - засягат само един ген и се причиняват от заместване, изтриване или вмъкване на допълнителни бази:
просто заместване (преход) - заместване на пурин с пурин или пиримидин с пиримидин;
комплексно заместване (трансверсия) - заместване на пурин с пиримидин или обратно;
заместване на един кодон (аминокиселина) с друг;
изместване на рамката на четене, което води до промени във всички следващи кодони (безсмислена мутация);
появата на безсмислени кодони, което води до спиране на транслацията в дадена точка;
хромозомни - засягат няколко гена:
делеции – загуба на ДНК фрагмент;
инверсия – завъртане на ДНК фрагмент на 180 0;
дупликация – повторение на ДНК фрагмент;
транслокация - преместване на ДНК фрагмент от една позиция в друга.
По посока:
директни – първични мутации;
обратни - вторични мутации, които възникват в същия ген под въздействието на друг мутаген, в резултат на което може да се възстанови оригиналният фенотип (ако фенотипът се възстанови без възстановяване на генотипа, мутацията се нарича супресор).
Последици за мутирали клетки:
неутрален – настъпила е мутация, но не е фенотипно проявена;
условно летален – частична загуба на характеристика или свойство;
летален - пълна загуба на черта или свойство, ако характеристиката е жизнена, тогава клетката умира.
Според фенотипната проява:
морфологични – загуба или промяна в морфологичните структури на клетката (форма, капсула, флагела и др.);
биохимични - загуба или промяна в способността за синтез на ензими, аминокиселини и др.
UFLводят до образуването на тиминови димери в ДНК (силни връзки между съседни тимини в същата верига), които пречат на работата на ДНК полимеразата, като по този начин нарушават репликацията на ДНК;
йонизиращо лъчениепричинява прекъсвания на едноверижна ДНК;
акридинови багрилапредизвикват изтриване или вмъкване на бази;
азотиста киселинаводи до дезаминиране на азотни основи със замяната на гуанин + цитозин с аденин + тимин (преход) и др.
Ремонте процес на възстановяване на ДНК, повредена в резултат на мутация, с помощта на специални ензимни системи.
Понастоящем са известни три основни указания за възстановяване на увредена ДНК:
незабавно директно връщане от увредена ДНК към оригиналната структура ( фотореактивиране);
загуба (изрязване) на увреждане, последвано от възстановяване на оригиналната структура на ДНК ( ексцизия тъмен ремонтИ Ремонт на ексцизия, медииран от ДНК гликозилаза);
активиране на механизми, които осигуряват устойчивост на увреждане ( пост-репликативна рекомбинационна поправка– осигурява репарации по време на процеса на рекомбинация, SOS-ремонт– податливи на грешки: попълването на дефекта е случайно, хаотично, поради което грешките са типични, несъответствие-ремонт– коригира грешни базови двойки).
Фотореактивация (лека, пострепликативна поправка) – отворен Келнер V 1949 г, е най-простият механизъм, чието действие може да се разпростре дори до едноверижна ДНК. Протича на един етап в светлината: при облъчване с видима светлина ензимът се активира - фотолиази, който разцепва пиримидиновите димери до мономери.
Фотореактивацията се характеризира с висока специфичност и пълно възстановяване на оригиналната структура на ДНК без допълнителни промени.
Ексцизионно тъмно (предварително репликативно) възстановяване – протича на няколко етапа без участието на светлина, т.е. на тъмно:
Рязане и отстраняване (разцепване) на увредената част от ДНК с помощта ендо- и екзонуклеази.
Почистване на съседни области и възстановяване на изтритата област с помощта на шаблона на втората верига на ДНК с помощта ДНК полимеразиаз.
Свързване на новосинтезираната секция с оригиналната ДНК верига с помощта на лигази.
Рекомбинационна променливост- това е генотипна вариабилност, която възниква, когато чужда ДНК се вмъкне в генома на клетката гостоприемник (същността е еднопосочен обмен на генетичен материал между донор и реципиент, различаващи се един от друг по една или повече характеристики, за да се създаде нов индивид - рекомбинантен, надарен със свойствата както на донора, така и на реципиента).
Ако генетичните рекомбинации при еукариотите възникват по време на сексуално размножаване с образуването на два рекомбинантни индивида, тогава прокариотите не се характеризират със сексуално размножаване и рекомбинациите в тях водят до образуването само на един рекомбинантен индивид, чийто геном е представен от генома на реципиент с включен в него донорен ДНК фрагмент.
Прехвърлянето на генетичен материал от една бактерия в друга става чрез трансформация, трансдукция и конюгация.
Трансформация(първо отваряне Ф. Грифитс V 1928 гпри експерименти с живи авирулентни (некапсулни) и убити вирулентни (капсулни) пневмококи върху бели мишки) е директен трансфер на генетичен материал (предварително изолирана и пречистена ДНК) от една бактерия (донор) към друга (реципиент) / промяна в свойства на една бактериална клетка под въздействието на ДНК, изолирана от друга бактериална клетка.
Трансформацията се извършва само при експерименти с бактерии от един и същи вид с различни генотипове.
Условия за трансформация:
реципиентната клетка трябва да е компетентна (да има рецептори на повърхността на клетъчната стена за адсорбция и проникване на донорна ДНК);
донорната ДНК трябва да има молекулно тегло най-малко 10 6 D;
наличието на двойна спирала на ДНК;
наличието на хомоложни региони в ДНК на донора и реципиента.
Адсорбция на двойноверижна донорна ДНК върху рецепторите на компетентна реципиентна клетка и ензимно разцепване на свързана ДНК с образуването на фрагменти с молекулно тегло 4-5 × 10 6 D.
Проникване на донорни ДНК фрагменти в реципиентната клетка с разрушаване на една от веригите.
Връзката на ДНК на донора с хомоложна област на хромозомата на реципиента.
Разграничете три вида трансдукция:
специфичен– бактериофагите пренасят строго определени гени от бактерията донор към бактерията реципиент (гени, разположени на хромозомата на клетката донор до профага) и могат да бъдат интегрирани само в строго определен локус на хромозомата на бактерията реципиент;
неспецифичен (генерализиран)– заедно с ДНК на фага, всички донорни гени, които могат да бъдат интегрирани във всяка точка на ДНК, могат да бъдат прехвърлени в клетката реципиент;
абортивно– ДНК фрагментът на донорната бактерия, донесен от фага, не е включен в хромозомата на реципиентната бактерия, но се намира в нейната цитоплазма и може да функционира в тази форма (когато бактериалната клетка се дели, донорният ДНК фрагмент се прехвърля само в една от двете дъщерни клетки и в крайна сметка се губи).
Донорната клетка изисква наличието на F-плазмид (сексуален фактор). Бактериите, които нямат F плазмид, са реципиенти.
Етапи на конюгиране на автономни плазмиди:
Прикрепване на донорна клетка към реципиентна клетка с помощта на генитални власинки.
Образуване на конюгативен мост между клетките.
Прехвърляне през конюгативен мост от донора към реципиента на F-плазмида и други плазмиди, разположени в цитоплазмата на донорната бактерия в автономно състояние.