Систематика и номенклатура микроорганизмов
Многочисленные микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы) строго систематизированы в определенном порядке по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука, называемая систематикой микроорганизмов. Раздел систематики, изучающий принципы классификации, называется таксономией.Таксон - группа организмов, объединенная по определенным однородным свойствам в рамках той или иной таксономической категории. Самой крупной таксономической категорией является царство, более мелкими - подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др.
В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические, молекулярно-биологические свойства. Весь мир микробов подразделяется на три царства:
. царство эукариотов (грибы и простейшие);
. царство прокариотов (бактерии, риккетсии, микоплазмы);
. царство вирусов.
Эукариоты подобны клеткам растений и животных. Они имеют поверхностную мембрану и внутриклеточную систему элементарных мембран, составляющих эндоплазматическую ретикулярную сеть и комплекс Гольджи. В цитоплазме эукариотов содержится оформленное ядро, митохондрии, рибосомы и ряд других органелл. Размножаются простые эукариоты половым и бесполым путями.
Прокариоты - организмы, не имеющие отграниченного ядра, внутриклеточной системы элементарных мембран и митохондрий, а некоторые лишены также клеточной стенки. Размножаются простым поперечным делением или почкованием.
Одной из основных таксономических категорий является вид (species) - совокупность особей, имеющих общий корень происхождения, сходный генотип и максимально близкие фенотипические признаки и свойства.
Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующаяся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называется чистой культурой.
Чистая культура микроорганизмов, выделенных из определенного источника и отличающихся от других представителей вида, называется штаммом. Штамм - более узкое понятие, чем вид или подвид. Близким к штамму является понятие клона; клон - это совокупность потомков, выращенных из одной микробной клетки.
Решением Международного конгресса для микроорганизмов рекомендованы следующие таксономические категории: царство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид.
Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, кишечная палочка пишется как Escherichia coli. Первое слово - название рода, которое начинается с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном написании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например E. Сoli.
Формы бактерий
Всем бактериям присущи определенные морфологические свойства (форма, размер, характер их расположения в мазке) и тинкториальные свойства (способность окрашиваться).Различают 4 основные формы бактерий (рис. 1.1): шаровидные (сферические), или кокковидные (от греч. kokkos - зерно); палочковидные (цилиндрические); извитые (спиралевидные); нитевидные. Кроме того, существуют бактерии, имеющие треугольную, звездообразную, тарелкообразную форму. Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8-ми или 16-ти клеток в виде пласта.
Рис. 1.1. Формы одноклеточных бактерий: а - микрококки; б - диплококки; в - стрептококки; г - стафилококки; д - сарцины; е - палочковидные бактерии; ж - спириллы; з - вибрионы
Кокковидные бактерии обычно имеют форму правильного шара диаметром 1,0-1,5 мкм; некоторые - бобовидную, ланцетовидную, эллипсовидную форму. По характеру взаиморасположения образующихся после деления клеток кокки подразделяют на следующие группы:
1. Микрококки (от лат. Micros - малый). Клетки делятся в одной плоскости и чаще всего сразу же отделяются от материнской. Располагаются поодиночке, беспорядочно (рис. 1.1. а).
2. Диплококки (от лат. diplos - двойной). Деление происходит в одной плоскости с образованием пар клеток, имеющих либо бобовидную, либо ланцетовидную форму (рис. 1.1. б).
3. Стрептококки (от лат. streptos - цепочка). Деление клеток происходит в одной плоскости, но размножающиеся клетки сохраняют между собой связь и образуют различной длины цепочки, напоминающие нити бус. Многие стрептококки являются вредными для человека и вызывают различные заболевания: скарлатину, ангину, гнойные воспаления и др. Например Streptococcus pyogenes (рис. 1.1.в).
4. Стафилококки (от лат. staphyle - гроздь винограда). Клетки делятся в нескольких плоскостях, а образующиеся клетки располагаются скоплениями, напоминающими гроздья винограда (рис. 1.1. г).
5. Тетракокки (от лат. tetra - четыре). Деление происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад.
6. Сарцины (от лат. sarcina - связка, тюк). Деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием пакетов (тюков) из 8-ми, 16-ти, 32-х и большего числа особей. Особенно часто встречаются в воздухе (рис. 1.1.д).
Палочковидные (цилиндрические формы) (рис. 1.1.е). По расположению палочки подразделяют:
- на одиночные или беспорядочно расположенные - монобактерии. Например, Escherihia coli;
- располагающиеся попарно (по одной линии) - диплобациллы, диплобактерии. Например, Pseudomonas;
- располагающиеся цепочкой - стрептобациллы, стрептобактерии. Например, Bacillus.
Палочки, образующие спору, подразделяют:
- на бациллы - аэробные спорообразующие бактерии. Спора у таких палочек располагается, как правило, центрально, и её диаметр не превышает ширины бактерии.
- клостридии - анаэробные спорообразующие бактерии. Спора у них располагается терминально или субтерминально. Она крупная, что растягивает оболочку бактерий, и они внешне напоминают веретено или теннисную ракетку.
Извитые (спиралевидные) формы
По количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток они подразделяются на три группы:1. Вибрионы (от греч. vibrio - извиваюсь, изгибаюсь) имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали. Например, Vibrio (рис. 1.1.з).
2. Спириллы (от греч. speira - завиток) - клетки, имеющие большой диаметр и малое (2-3) количество завитков. Например - Spirillium minor (рис. 1.1. ж).
3. Спирохеты (от греч. speira - завиток, chaita - волос) - спиралевидной формы подвижные бактерии.
Нитевидные формы
Различают два типа нитевидных бактерий: образующие временные нити и постоянные.Временные нити (иногда с ветвлениями) образуют палочковидные бактерии при нарушении условий их роста или регуляции клеточного деления (микобактерии, коринебактерии, а также риккетсии, микоплазмы, многие грамотрицательные и грамположительные бактерии). При восстановлении механизма регуляции деления и нормальных условий роста эти бактерии восстанавливают обычные для них размеры.
Постоянные нитевидные формы образуются из палочковидных клеток, соединяющихся в длинные цепочки либо с помощью слизи, либо чехлами, либо мостиками (серобактерии, железобактерии).
Для изучения тинкториальных свойств микроорганизмов и их морфологии используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные).
Наибольшее применение имеют основные краски: метиленовый синий, основной фуксин, генцианвиолет, везувин, хризоидин и др. Реже применяются нейтральные (нейтральный красный) и кислые (эозин) краски. Из названных красок готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях для повышения красящей силы раствора к нему добавляют протравы, например карболовую кислоту, щелочь и др.
Для определения формы бактерий и их взаимного расположения в мазке используют простые методы окраски, т. е. окраска осуществляется одним красителем и мазок получается окрашенным одним цветом. Например, метиленовый синий. Эта окраска позволяет лучше выявить бобовидную форму и парное расположение кокков.
Для изучения структуры бактериальной клетки и выявления особенностей её строения применяют сложные методы окраски, которые включают в себя целый ряд красящих веществ, протравы и дифференцирующие вещества. К сложным методам окраски относятся методы Грама, Нессера, Ожешко и др.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Подавляющее большинство бактерий одноклеточны. По форме клеток они могут быть округлыми (кокки), палочковидными (бациллы, клостридии, псевдомонады), извитыми (вибрионы, спириллы, спирохеты), реже - звёздчатыми, тетраэдрическими, кубическими, C- или O-образными. Формой определяются такие способности бактерий, как прикрепление к поверхности, подвижность, поглощение питательных веществ. Отмечено, например, что олиготрофы, то есть бактерии, живущие при низком содержании питательных веществ в среде, стремятся увеличить отношение поверхности к объёму, например, с помощью образования выростов (т. н. простек).
Из обязательных клеточных структур выделяют три:*нуклеоид *рибосомы *цитоплазматическая мембрана (ЦПМ)
С внешней стороны от ЦПМ находятся несколько слоёв (клеточная стенка, капсула, слизистый чехол), называемых клеточной оболочкой, а также поверхностные структуры (жгутики, ворсинки). ЦПМ и цитоплазму объединяют вместе в понятие протопласт.
2.Генетика вирусов. Патогенные для человека вирусы обладают двумя основными свойствами - наследственностью и изменчивостью , изучение которых составляет предмет особой научной дисциплины - генетики вирусов.Популяционную структуру вирусов и характер протекающих в них процессов определяют следующие факторы. Высокая численность популяции , что увеличивает вероятность мутаций, которые могут быть подхвачены естественным отбором при изменении условий существования вирусов. Быстрая смена поколений позволяет изучать изменчивость вирусов не только в эксперименте, по и наблюдать их естественную эволюцию в природе. Гаплоидностъ и бесполый способ размножения определяют: генетическую чистоту популяции (отсутствие гибридов); невозможность сохранения запасов изменчивости за счёт диплоидности; немедленное попадание мутантов под контроль отбора.
Малая ёмкость генома и отсутствие повторяющихся генов . Для реализации инфекционного цикла необходима функциональная целостность всех генов.
Незначительное изменение одного из них может вызвать летальный или условно-летальный эффект для вируса.
Непрерывность в динамике эпидемического процесса , так как обязательное условие сохранения в природе - передача новым чувствительным хозяевам. Вирусные популяции хорошо адаптированы к внешним условиям и не претерпевают существенных изменений в течение продолжительного времени. При изменении условий для выживания популяции становится необходимой перестройка наследственной структуры , обеспечивающая адаптацию к новой среде. Подобная перестройка возможна лишь при наличии в общем генофонде популяции изменённых генов. Генофонд вирусных популяций создаётся и пополняется из четырёх основных источников: внутренние факторы: мутации, рекомбинации. Внешние: включение в геном генетического материала клетки-хозяина (появление геномов, содержащих новый материал), Фенотипическая смешивание(обогащение генофонда за счёт поступления генов из других вирусных популяций).
3.Возбудители холеры. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение. Семейство Vibrionaceae, род Vibrio, вид V. cholerae.Холера - древний антропоноз; со времен Гиппократа известна как "magi mara" - "великий мор". Уносила миллионы жизней. Карантинная инфекция.
Морфология. Грам(-), слегка изогнутые палочки (вид запятой. спор и капсул (кроме штамма Бенгал) не образуют; штамм Бенгал образует капсулу в организме. Облигатные аэробы. Монотрихи, длина жгутика может в 2-3 раза превышать длину сомы, что обуславливает высокую подвижность. Культуральныесвойства. Хорошо растут на простых питательных средах с щелочной реакцией (pH 8,5 - 9,5). На 1% пептонной воде образует нежную пленку (аэроб). На щелочном агаре - чаще гладкие прозрачные колонии с голубоватым оттенком, реже (в процессе диссоциации) - шероховатые и складчатые колонии. Биохимические свойства. В лабораторной практике используется биохимическая классификация по Хейбергу (для всего рода Vibrio). Выделяют 8 групп, возбудители холеры относятся к 1й группе (манноза к, сахароза к, арабиноза -). Образуют индол. Антигенная структура: (1) общий видо специфический H-АГ - жгутиковый (2) типо специфический О-АГ - соматический По О-АГ выделяют 80 серогрупп; V. cholerae, el-tor - серогруппа 01 (02 вызывает энтериты, гастроэнтериты). О1-АГ состоит из фракций А, В и С, их сочетания образуют серовары. 3 серовара : Инаба (АС), Огава (АВ) (основные возбудители), Гикошима (АВС) (промежуточный вариант). Штамм bengal - серовар 0-139. Факторы патогенности: (1) жгутики - активное продвижение бактерий к энтероцитам в слое слизи; (2) адгезивность - пили; (3) капсула у штамма Бенгал; (4) токсины : 1 типа - эндотоксин (О-АГ), 2 типа – экзоэнтеротоксин - холероген, основной признак; идентичен у всех трех возбудителей. 2 субъединицы: В - нетоксична, способствует адгезии токсина к энтероцитам; А - собственно токсин, проникает в энтероциты, где активирует АЦ, что приводит к накоплению цАМФ, который усиливает секрецию воды, натрия и хлора из клеток и нарушает всасывание калия; 3 типа - термостабильный токсин , поражает натрий-калиевую АТФазу; в результате - диарея, резкое обезвоживание организма; (5) нейраминидаза - способствует адгезии вибрионов на энтероцитах и проникновению в клетку; Заболевание. Источник - больной, вибрионоситель. Резервуар - гидробионты. Путь заражения - алиментарный, при употреблении инфицированной воды (овощи, гидробионты etc.). Основные клинические формы - холерный энтерит, гастроэнтерит. Инкубационный период - несколько часов - 6 дней. Первый симптом - диарея, Второй симптом - обильная многократная рвота фонтаном, обезвоживания, обессоливания организма, мышечной слабости, головокружению, осиплости голоса, резкой потере тургора кожи. Микробиологическая диагностика : (1) экспресс-методы : для определения АГ возбудителей: РИФ, РНГА по Рыцаю, метод иммобилизации вибрионов с помощью О-холерной сыворотки; учет в темнополевом и фазово-контрастном микроскопе. (2) основной метод - бактериологический .(3) дополнительный - серологический: определение вибриоцидных АТ в сыворотке пациента с помощью реакции бактериолиза (для реконвалесцентов). (4) генетический - использование молекулярно-генетических зондов к генам tox+ возбудителей токсина. Лечение . В первую очередь - восстановление водно-солевого обмена, а затем - использование антибиотиков, химиотерапии. Восстановление водно-солевого обмена должно производиться путем введения солевых растворов per os или в/в: KCl, NaCl, NaHCO3, глюкоза etc. Объем вводимой и выводимой жидкости должен строго контролироваться.Профилактика. 6-месячный иммунитет, не профилактируют штамм Бенгал. 1) вакцина холерная корпускулярная инактивированная из V. cholerae, V. el-tor; 2) химическая холерная вакцина - моно (содержит холероген-анатоксин и О-АГ серовара Инаба); 3)химическая холерная вакцина - би (серовары Огава, Инаба).
1.Принципы классификации бактерий. Для бактерий рекомендованы следующие таксономические категории: класс, отдел, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, возбудитель сифилиса пишется как Treponema pallidum . Первое слово - название рода и пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном упоминании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например: Т. pallidum . Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерным организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутствуют высокоорганизованные органеллы Бактерии делят на 2 домена: « Bacteria » и « Archaea ». В домене « Bacteria » можно выделить следующие бактерии:
1) бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамм(-);
2) бактерии с толстой клеточной стенкой, грамм(+);
3) бакт. без КС (класс Mollicutes - микоплазмы)
Архебактерии не содержат пептидогликан в клеточной стенке. Они имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК). Среди тонкостенных грамм(-) эубактерий различают:
Сферические формы, или кокки (гонококки, менингококки, вейлонеллы);
Извитые формы - спирохеты и спириллы;
Палочковидные формы, включая риккетсии.
К толстостенным грамм(+) эубактериям относят:
Сферические формы, или кокки (стафилококки, стрептококки, пневмококки);
Палочковидные формы, а также актиномицеты (ветвящиеся, нитевидные бактерии), коринебактерии (булавовидные бактерии), микобактерии и бифидобактерии.
Тонкостенные грамм(-) бактерии: Менингококки, гонококки, Вейлонеллы, Палочки, Вибрионы, Кампилобактерии, Хеликобактерии, Спириллы, Спирохеты, Риккетсии, Хламидии.
Толстостенные грамм(+) бактерии: Пневмококки, Стрептококки, Стафилококки, Палочки, Бациллы, Клостридии, Коринебактерии, Микобактерии, Бифидобактерии, Актиномицеты.
2.Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления. Антибиотикорезистентность - это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.
Природная устойчивость . Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).
Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности - это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы - от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).
Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:
Мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя ре-зистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (се¬рия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка);
Переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной к ампициллину;
Переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться далее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.
Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и пройти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего препарат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна на каждом из следующих этапов:
модификация мишени . Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен действию данного препарата.
«недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик.
инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы - это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды.
Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества - ингибиторы (например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.
Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас-пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10-15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по воз-можности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использвать их как фактор роста).
Микроорганизмов.
Форма и размеры микроорганизмов весьма разнообразны.
По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов.
1.Шаровидные или кокки (с греч.- зерно).
2.Палочковидные.
3.Извитые.
Кокковидные бактерии (кокки) по характеру взаиморасположения после деления подразделяются на ряд вариантов.
1.Микрококки . Клетки расположены в одиночку. Входят в состав нормальной микрофлоры, находятся во внешней среде. Заболеваний у людей не вызывают.
2.Диплококки. Деление этих микроорганизмов происходит в одной плоскости, образуются пары клеток. Среди диплококков много патогенных микроорганизмов - гонококк, менингококк, пневмококк.
3.Стрептококки. Деление осуществляется в одной плоскости, размножающиеся клетки сохраняют связь (не расходятся), образуя цепочки. Много патогенных микроорганизмов - возбудители ангин , скарлатины, гнойных воспалительных процессов.
4.Тетракокки . Деление в двух взаимоперпендикулярных плоскостях с образованием тетрад (т. е. по четыре клетки). Медицинского значения не имеют.
5.Сарцины . Деление в трех взаимоперпендикулярных плоскостях, образуя тюки (пакеты) из 8, 16 и большего количества клеток. Часто обнаруживают в воздухе.
6.Стафилококки (от лат.- гроздь винограда). Делятся беспорядочно в различных плоскостях, образуя скопления, напоминающие грозди винограда. Вызывают многочисленные болезни, прежде всего гнойно-воспалительные.
Палочковидные формы микроорганизмов.
1.Бактерии - палочки, не образующие спор.
2.Бациллы - аэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры обычно не превышает размера (“ширины”) клетки (эндоспоры).
3.Клостридии - анаэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры больше поперечника (диаметра) вегетативной клетки, в связи с чем клетка напоминает веретено или теннисную ракетку.
Необходимо иметь в виду, что термин “бактерия” часто используют для обозначения всех микробов-прокариот. В более узком (морфологическом) значении бактерии - палочковидные формы прокариот, не имеющих спор.
Извитые формы микроорганизмов.
1.Спириллы - имеют 2- 3 завитка.
2.Спирохеты - имеют различное число завитков, аксостиль - совокупность фибрилл, специфический для различных представителей характер движения и особенности строения (особенно концевых участков). Из большого числа спирохет наибольшее медицинское значение имеют представители трех родов - Borrelia, Treponema, Leptospira.
Строение бактериальной клетки.
Обязательными органоидами являются : нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана.
Необязательными (второстепенными) структурными элементами являются : включения, капсула, споры, пили, жгутики.
1.В центре бактериальной клетки находится нуклеоид - ядерное образование, представленное чаще всего одной хромосомой кольцевидной формы. Состоит из двухцепочечной нити ДНК. Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной.
Основные свойства вирусов , по которым они отличаются от остального живого мира.
1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие - от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.
3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению.
4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.
6.Средой обитания вирусов являются живые клетки - бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.
Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной - вирион и внутриклеточной - вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов - конечной фазы развития вирусов.
Строение (морфология) вирусов.
1.Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК-вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК- вирусов).
2.Капсид - белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц - капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид - спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).
При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего - двадцатигранники - икосаэдры.
3.Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид , т. е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”.
4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина - суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”.
Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов - плазмиды, вироиды и прионы.
Морфология риккетсий
Риккетсии не имеют спор, капсул, неподвижны. Грамотрицательны. По Романовскому-Гимзе и по способу Здродовского окрашиваются в красный цвет. Строение клеточной стенки сходно со строением стенки грамотрицательных бактерий.
Являются возбудителями сыпного тифа, болезни Брила.
Морфологическая характеристика грибов.
Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению, видимое движение цитоплазмы). Ядерный материал грибов отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры - гифы . Мицелий - переплетение гиф - основная морфологическая структура. У низших грибов мицелий одноклеточный, не имеет внутренних перегородок (септ ). Грибы размножаются половым и бесполым (вегетативным) способом. При вегетативном размножении образуются специализированные репродуктивные структуры – споры - конидии . Они могут располагаться в специализированных вместилищах - спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры).
Конидиоспоры - зрелые наружные споры, возникающие на дифференцированных конидиофорах (конидионосцах), отличающихся от других нитей мицелия по форме и размерам (у аспергилла, пеницилла) или располагающиеся по бокам и на концах любой ветви мицелия, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой.
К эндоспорам совершенных грибов относятся спорангиоспоры мукоровых грибов, развивающихся в специальных органах (спорангиях), располагающихся на вершине спорангиеносца. Споры освобождаются при разрыве стенки спорангия.
Основное функциональное отличие спор у бактерий и грибов: у бактерий споры обеспечивают переживание в неблагоприятных условиях окружающей среды, у грибов образование спор - способ размножения.
Морфологическая характеристика актиномицетов (лучистых грибов по старым классификациям). Актиномицеты - формы бактерий, имеющие истинный, не имеющий перегородок мицелий. Мицелиальный (в виде ветвящихся нитей) рост этих грамположительных бактерий придает им внешнее сходство с грибами. Это сходство усиливается вследствие наличия у высших форм актиномицетов наружных неполовых спор, которые называются конидиями.
В отличие от грибов, актиномицеты имеют прокариотическое строение клетки, не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, размножаются только бесполым путем. У низших актиномицетов мицелий фрагментируется на типичные одноклеточные бактерии.
Обычным местом обитания для большинства из них является почва. Однако ряд видов актиномицет могут инфицировать раны и вызывать образование абсцессов . С некоторыми актиномицетами (например, стрептомицетами) связана способность выработки антибиотиков.
Бактерии относятся к одноклеточным организмам, принадлежат к растительному миру и не содержащим хлорофилла. Наиболее крупными явл.бактерии сибирской язвы и газовой гангрены, а наиболее мелкими ― возбудители бруцеллеза и туляремии.
Три основные формы бактерий
: шаровидные (кокки), палочковидные (бактерии, бациллы) и извитые (вибрионы и спириллы).
Шаровидные формы ― по внешнему виду кокки имеют форму шара. Большинство кокков ― сапрофиты, они не образуют спор, неподвижны, широко распространены в природе. Клетки, остающиеся несоед. друг с другом после деления и видимые в препарате как отдельно лежащие кокки, называются микрококками. Клетки, делящиеся в одной плоскости и после деления остающиеся соедин. по две, называются диплококками. Тетракокки и сарцины широко распростр. и не обладают патогенными свойствами.
Палочковидные формы бывают спороносные и песпороносные. По величине: крупные, средние и мелкие палочки, имеющие цилиндр. и овальную форму. Концы клеток могут быть закруглены или срезаны. Клетки, образ. на концах булавовидные утолщения и зернистые включения, наз. коринебактериями. Из коринебактерий к патогенным видам относ. возбудитель дифтерии.
Извитые формы широко распространены в природе. К ним относятся спириллы и вибрионы. Спириллы имеют штопорообразную извитую форму и несколько завитков. Среди спирилл встречается патогенный вид, вызывающий болезнь Содоку. Вибрионы имеют изогнутую форму, напоминающую запятую.
Под влиянием различных факторов внешней среды (t, влажность, биолог. факторы, искусствен. питательные среды) бактерии часто и резко меняют морфологию и некоторые другие свойства.
Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению).
Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры - гифы. Мицелий- переплетение гифов- основная морфологическая структура. У низших грибов мицелий одноклеточный, не имеет внутренних перегородок (септ ). Грибы размножаются половым и вегетативным способом. При вегетативном размножении образуются споры - конидии . Они могут располагаться в специализированных вместилищах - спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры). Дрожжевые клетки размножаются почкованием, мицелий не образуют.
Водоросли - относятся к растениям. Содержат светочувствительные пигменты, которые находятся в хлоропластах. Благодаря этим пигментам они способны осуществлять фотосистему.
2 типа: зеленая водоросль, диатомовая водоросль
Вирусы открыты при изучении листьев табачной мазаики.
Особенности:
1.Очень маленький размер
2.Не имеют клеточного строения
3.Не могут расти на питательных средах и осущ. бинарное деление
4.Не имеют собственных метаболических систем
6.Репродукция, т.е. воспроизводство вируса осуществляется только в клетке хозяина
Многоклеточные животные организмы : коловратки, черви, низшие ракообразные
Микроорганизмы (от лат. micros - малый) - организмы, невидимые невооруженным глазом. К ним относятся простейшие, спирохеты, грибы, бактерии, вирусы, изучением которых занимается микробиология. Величина микроорганизмов измеряется в микрометрах (мкм). В микромире существует большое разнообразие форм, которые делятся на группы с учетом общих принципов биологической классификации.
Первой общей биологической классификацией была созданная в XVIII веке система шведского ученого К. Линнея, основанная на морфологических признаках и включавшая животный и растительный мир. С развитием науки в классификации стали учитывать не только морфологические, но и физиологические, биохимические и генетические особенности микроорганизмов. В настоящее время невозможно говорить об единой классификации всех живых организмов: сохраняя единые принципы, классификации макро- и микроорганизмов имеют свои особенности.
Основными ступенями всех классификаций являются: царство - отдел - класс (группа) - порядок - семейство - род - вид. Главной классификационной категорией является вид - совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные морфологические и физиологические признаки и обмен веществ.
Микроорганизмы относятся к царству прокариотов, представители которых, в отличие от эукариотов, не обладают оформленным ядром. Наследственная информация у прокариотов заключена в молекуле ДНК, располагающейся в цитоплазме клетки.
Для микроорганизмов принята в 1980 г. единая международная классификация, в основе которой лежит система, предложенная американским ученым Берги.
Для того чтобы определить, к какому виду относится микроорганизм, необходимо с помощью различных методов изучить его особенности (форму клетки, спорообразование, подвижность, ферментативные свойства) и по определителю найти его систематическое положение - идентифицировать.
Внутри вида существуют варианты: морфоварианты отличаются по морфологии, биоварианты - по биологическим свойствам, хемоварианты - по ферментативной активности, сероварианты - по антигенной структуре, фаговарианты - по чувствительности к фагам.
Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная или биноминальная (двойная) номенклатура, введенная К.Линнеем. Первое название обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus - стафилококк золотистый. В названиях могут быть отражены имена исследователей, открывших микроорганизмы: бруцеллы - в честь Брюса, эшерихии - в честь Эшериха и т. д. В ряд наименований включены органы, которые поражает данный микроорганизм: пневмококки - легкие, менингококки - мозговую оболочку и т. д.
Бактерии
Бактерии - это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. Средние размеры бактериальной клетки - 2-6 мкм. Размеры и форма клеток бактерий, присущие микроорганизмам определенного вида, могут изменяться под влиянием различных факторов (в зависимости от возраста бактериальной культуры, среды обитания и пр). Это явление называется полиморфизмом.
По форме клетки бактерии делятся на три группы: шаровидные, палочковидные и извитые (рис. 4).
Шаровидные бактерии называются кокки (от лат. coccus - ягода) и имеют диаметр клетки от 0,5 до 1 мкм. Форма кокков разнообразна: сферическая, ланцетовидная, бобовидная. По взаимному расположению клеток после деления среди кокков выделяют: микрококки (от лат. micros - малый) - клетки делятся в разных плоскостях и располагаются поодиночке; диплококки (от лат. diploos - двойной) - клетки делятся в одной плоскости и затем располагаются попарно; к ним относятся ланцетовидные пневмококки и бобовидные гонококки и менингококки; стрептококки (от лат. streptos - цепочка) - клетки делятся в одной плоскости и не расходятся, образуя цепочку; стафилококки (от лат. staphyle - гроздь) - клетки делятся в различных плоскостях, образуя скопления в виде грозди винограда; тетракокки (от лат. tetra - четыре) - клетки делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются по четыре; сарцины (от лат. sarcio - соединяю) - клетки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются в виде тюков или пакетов по 8 или 16 клеток в каждом.
Кокки широко распространены во внешней среде, а также в организме человека и животных. Почти все группы кокков, исключая микрококки, тетракокки и сарцины, включают возбудителей инфекционных заболеваний.
Палочковидные формы называются бактериями. Средние размеры их от 1 до 6 мкм в длину и от 0,5 до 2 мкм в толщину.
Бактерии различаются по внешнему виду: концы их могут быть закругленными (кишечная палочка), обрубленными (возбудитель сибирской язвы), заостренными (возбудитель чумы) или утолщенными (возбудитель дифтерии). После деления бактерии могут располагаться попарно - диплобактерии (клебсиеллы), цепочкой (возбудитель сибирской язвы), иногда под углом друг к другу или крест-накрест (возбудитель дифтерии). Большинство бактерий располагается беспорядочно.
Среди бактерий встречаются изогнутые формы - вибрионы (возбудитель холеры).
К извитым формам относятся спириллы и спирохеты. Форма их клетки напоминает спираль. Большинство спирилл неболезнетворны.
Строение бактериальной клетки
Для изучения строения бактериальной клетки наряду со световым микроскопом применяют электронно-микроскопические и микрохимические исследования, позволяющие определить ультраструктуру бактериальной клетки.
Бактериальная клетка (рис. 5) состоит из следующих частей: трехслойной оболочки, цитоплазмы с различными включениями и ядерного вещества (нуклеоида). Дополнительными структурными образованиями являются капсулы, споры, жгутики, пили.
Оболочка клетки состоит из наружного слизистого слоя, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны.
Слизистый капсульный слой находится снаружи клетки и выполняет защитную функцию.
Клеточная стенка - один из основных структурных элементов клетки, сохраняющий ее форму и отделяющий клетку от окружающей среды. Важным свойством клеточной стенки является избирательная проницаемость, которая обеспечивает проникновение в клетку необходимых питательных веществ (аминокислот, углеводов и др.) и выведение из клетки продуктов обмена. Клеточная стенка сохраняет внутри клетки постоянное осмотическое давление. Прочность стенки обеспечивает муреин, вещество полисахаридной природы. Некоторые вещества разрушают клеточную стенку, например лизоцим.
Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются протопластами. Они сохраняют способность к дыханию, делению, синтезу ферментов; к воздействию внешних факторов: механическому повреждению, осмотическому давлению, аэрации и др. Сохранить протопласты можно только в гипертонических растворах.
Бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой называются сферопластами. Если подавить процесс синтеза клеточной стенки с помощью пенициллина, то образуются L-формы, которые у всех видов бактерий представляют шаровидные крупные и мелкие клетки с вакуолями.
Цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке с внутренней стороны. Она очень тонкая (8-10 нм) и состоит из белков и фосфолипидов. Это пограничный полупроницаемый слой, через который осуществляется питание клетки. В мембране находятся ферменты пермеазы, осуществляющие активный перенос веществ, и ферменты дыхания. Цитоплазматическая мембрана образует мезосомы, принимающие участие в делении клетки. При помещении клетки в гипертонический раствор мембрана может отделиться от клеточной стенки.
Цитоплазма - внутреннее содержимое бактериальной клетки. Она представляет собой коллоидную систему, состоящую из воды, белков, углеводов, липидов, различных минеральных солей. Химический состав и консистенция цитоплазмы изменяются в зависимости от возраста клетки и условий окружающей среды. В цитоплазме находятся ядерное вещество, рибосомы и различные включения.
Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат. Ядерное вещество прокариотов в отличие от эукариотов не имеет собственной мембраны. Нуклеоид зрелой клетки представляет собой двойную нить ДНК, свернутую в кольцо. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки. По генетической терминологии ядерное вещество получило название генофор или геном.
Рибосомы находятся в цитоплазме клетки и выполняют функцию синтеза белка. В состав рибосомы входит 60% РНК и 40% белка. Количество рибосом в клетке достигает 10000. Соединяясь вместе, рибосомы образуют полисомы.
Включения - гранулы, содержащие различные запасные питательные вещества: крахмал, гликоген, жир, волютин. Они расположены в цитоплазме.
Клетки бактерий в процессе жизнедеятельности образуют защитные органеллы - капсулы и споры.
Капсула - внешний уплотненный слизистый слой, примыкающий к клеточной стенке. Это защитный орган, который появляется у некоторых бактерий при попадании их в организм человека и животных. Капсула предохраняет микроорганизм от защитных факторов организма (возбудители пневмонии и сибирской язвы). Некоторые микроорганизмы имеют постоянную капсулу (клебсиеллы).
Споры встречаются только у палочковидных бактерий. Они образуются при попадании микроорганизма в неблагоприятные условия внешней среды (действие высоких температур, высыхание, изменение рН, уменьшение количества питательных веществ в среде и т. д.). Споры находятся внутри бактериальной клетки и представляют уплотненный участок цитоплазмы с нуклеоидом, одетый собственной плотной оболочкой. По химическому составу они отличаются от вегетативных клеток малым количеством воды, увеличенным содержанием липидов и солей кальция, что способствует высокой устойчивости спор. Спорообразование происходит в течение 18-20 ч; при попадании микроорганизма в благоприятные условия спора в течение 4-5 ч прорастает в вегетативную форму. В бактериальной клетке образуется только одна спора, следовательно, споры не являются органами размножения, а служат для переживания неблагоприятных условий.
Спорообразующие аэробные бактерии называются бациллами, а анаэробные - клостридиями.
Споры отличаются по форме, размерам и расположению в клетке. Они могут располагаться центрально, субтерминально и терминально (рис. 6). У возбудителя сибирской язвы спора располагается центрально, ее размер не превышает поперечника клетки. Спора возбудителя ботулизма расположена ближе к концу клетки - субтерминально и превышает ширину клетки. У возбудителя столбняка округлая спора располагается на конце клетки - терминально и значительно превышает ширину клетки.
Жгутики - органы движения, характерны для палочковидных бактерий. Это тонкие нитевидные фибриллы, состоящие из белка - флагеллина. Длина их значительно превышает длину бактериальной клетки. Жгутики отходят от базального тельца, расположенного в цитоплазме, и выходят на поверхность клетки. Наличие их можно обнаружить по определению подвижности клеток под микроскопом, в полужидкой питательной среде или при окраске специальными методами. Ультраструктура жгутиков изучена в электронном микроскопе. По расположению жгутиков бактерии делят на группы (см. рис. 6): монотрихи - с одним жгутиком (возбудитель холеры); амфитрихи - с пучками или единичными жгутиками на обоих концах клетки (спириллы); лофотрихи - с пучком жгутиков на одном конце клетки (фекальный щелочеобразователь); перитрихи - жгутики расположены по всей поверхности клетки (кишечные бактерии). Скорость движения бактерий зависит от количества и расположения жгутиков (наиболее активны монотрихи), от возраста бактерий и влияния окружающих факторов.
Пили или фимбрии - ворсинки, расположенные на поверхности бактериальных клеток. Они короче и тоньше жгутиков и также имеют спиральную структуру. Состоят пили из белка - пилина. Одни пили (их несколько сотен) служат для прикрепления бактерий к клеткам животных и человека, с другими (единичными) связана передача генетического материала из клетки в клетку.
Микоплазмы
Микоплазмы - клетки, не имеющие клеточной стенки, но окруженные трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Микоплазмы могут быть сферической, овальной формы, в виде нитей и звезд. Микоплазмы по классификации Берги выделены в отдельную группу. В настоящее время этим микроорганизмам уделяется все большее внимание как возбудителям заболеваний воспалительного характера. Размеры их различны: от нескольких микрометров до 125-150 нм. Мелкие микоплазмы проходят через бактериальные фильтры и называются фильтрующимися формами.
Спирохеты
Спирохеты (см. рис. 52) (от лат. speira - изгиб, chaite - волосы) - тонкие, извитые, подвижные одноклеточные организмы, имеющие размеры от 5 до 500 мкм в длину и 0,3-0,75 мкм в ширину. С простейшими их роднит способ движения путем сокращения внутренней осевой нити, состоящей из пучка фибрилл. Характер движения спирохет различен: поступательное, вращательное, сгибательное, волнообразное. В остальном строение клетки типичное для бактерий. Некоторые спирохеты слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Спирохеты разделяют на роды по количеству и форме завитков нити и ее окончанию. Кроме сапрофитных форм, распространенных в природе и организме человека, среди спирохет имеются болезнетворные - возбудители сифилиса и других заболеваний.
Риккетсии
Вирусы
Среди вирусов выделяют группу фагов (от лат. phagos - пожирающий), вызывающих лизис (разрушение) клеток микроорганизмов. Сохраняя присущие вирусам свойства и состав, фаги отличаются структурой вириона (см. главу 8). Они не вызывают заболеваний человека и животных.
Контрольные вопросы
1. Расскажите о классификации микроорганизмов.
2. Назовите основные свойства представителей царства прокариотов.
3. Перечислите и охарактеризуйте основные формы бактерий.
4. Назовите основные органеллы клетки и их назначение.
5. Дайте краткую характеристику основных групп бактерий и вирусов.
Изучение морфологии микроорганизмов
Для изучения морфологии микроорганизмов применяют микроскопический метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выращенные на питательных средах в лабораторных условиях.
Техника приготовления мазка
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде . Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде . На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Приготовление мазка из гноя или мокроты . Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.
Приготовление мазка из крови . Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.
Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции . Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух - трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.
2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.
Рецепты красителей
1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):
Красителя - 1 г спирта 96% - 10 мл
Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.
2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):
Насыщенного спиртового раствора основного фуксина - 10 мл раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл
Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.
3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):
Фуксина Циля - 1 мл воды дистиллированной - 9 мл
Краситель готовят непосредственно перед применением.
4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):
насыщенного спиртового раствора
генцианового фиолетового - 10 мл
карболовой кислоты 5% - 100 мл
Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):
Йодида калия - 2 г кристаллического йода - 1 г дистиллированной воды - 10 мл
Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.
6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:
Насыщенного спиртового раствора метиленового синего - 30 мл раствора гидроксида калия 1% - 1 мл дистиллированной воды - 100 мл
7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):
1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.
Простой метод окраски
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.
1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).
Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).
Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.
1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).
Прижизненная окраска микроорганизмов
Для изучения живой культуры используют чаще всего метиленовый синий и другие красители в больших разведениях (1:10000). Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с помощью объектива 40×.
Изучение подвижности микроорганизмов
Для исследования используют культуру бактерий, выращенных в жидкой питательной среде, или взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида.
Метод раздавленной капли . На предметное стекло наносят пипеткой каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.
Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой находится влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Чашку закрывают крышкой.
Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле (см. главу 2).
Метод висячей капли (рис. 8). Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина.
На покровное стекло наносят каплю культуры. Затем осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии сначала при малом увеличении (8×) находят край капли, а затем проводят изучение препарата при большом увеличении.
Контрольные вопросы
1. Как приготовить бактериальную петлю?
2. Назовите цели и способы фиксации мазков.
3. Назовите основные красители.
4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?
Задание
1. Возьмите готовые препараты, изучите их и зарисуйте основные формы микроорганизмов.
2. Приготовьте мазки из различного материала (культуры, гноя, крови, мазки-отпечатки).
3. Окрасьте препараты сложными методами (по Граму, Цилю - Нильсену, Ожешко, Бурри - Гинсу).